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quarta-feira, 1 de julho de 2015

Prevalência e susceptibilidade de leveduras vaginais



Prevalence and susceptibility of vaginal yeast


Leonilda Chiari GalleI; Maria José Soares Mendes GianinniII
IMestre em Análises Clínicas; professora de Citologia Clínica da Faculdade de Farmácia da Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE); biologista do Instituto Adolfo Lutz/Laboratório de Presidente Prudente
IIProfessora-adjunta do Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista (UNESP)/campus de Araraquara



RESUMO
Entre as vulvovaginites, a candidíase é apontada como a causa mais freqüente em mulheres na idade fértil. Atualmente, várias pesquisas mostram aumento na freqüência das espécies não-albicans e grande preocupação com episódios de repetição, assim como sua relação com a resistência ao tratamento.
OBJETIVO: O presente estudo teve como objetivo verificar a distribuição de gêneros e espécies de leveduras causadoras de vaginite e analisar o perfil de sensibilidade das leveduras frente às drogas antifúngicas.
MATERIAL E MÉTODO: Foram colhidas amostras de fluido vaginal de 250 pacientes para cultura, realizados identificação e antifungigrama dos isolados.
RESULTADOS: Leveduras do gênero Candida estavam presentes em 27,6% das amostras. Candida albicans foi a levedura mais isolada em 74% dos casos, seguida de Candida glabrata, em 14,5%; Candida tropicalis, em 7,3%; e Candida parapsilosis, em 4,3%. Todos os isolados Candida albicans foram sensíveis à anfotericina B, e apenas um isolado da espécie não-albicans apresentou concentração inibitória mínima (CIM) mais elevada (2µg/ml). Em Candida albicans, 5,9% das amostras mostraram-se sensíveis, dependendo da dose de fluconazol, e 9,8%, resistentes. Apenas um isolado mostrou-se resistente, com CIM de 8µg/ml, para itraconazol. Nas espécies não-albicans, 11,7% dos isolados foram considerados resistentes ao fluconazol e 23,5, ao itraconazol.
CONCLUSÃO: Candida albicans foi a espécie mais freqüentemente encontrada na microbiota vaginal; no entanto, outras espécies foram também comuns nessa população. Porcentual importante de isolados de Candida albicans e não-albicans foi resistente a fluconazol e itraconazol, mostrando a importância de realização de testes de identificação e antifungigrama para os episódios de candidíase vaginal.
Unitermos: Candidíase, Fluido vaginal, Antifungigrama

ABSTRACT
Among the vulvovaginitis, candidiasis is the most frequent cause in women at reprodutive age of and several researches have shownd an increase in the frequency of the species non-albicans, and a great concern with repetitive episodes, as well as its relationship with the resistance to the treatment.
OBJECTIVE: The purpose of this study was to verify the yeast species that cause vaginitis and their susceptibility to antifungal agents.
MATERIAL AND METHOD: Vaginal swabs were colleted from 250 patients and were evaluated for culture, species identification and susceptibility to antifungal agents.
RESULTS: Candida was present in 27.6% of the samples. Candida albicans was the predominant species (74%), followed by Candida glabrata (14.5%), Candida tropicalis (7,3%) and Candida parapsilosis (4,3%). All the C. albicans isolates were susceptible to anfotericin B and only one sample of non-albicans showed greater MIC (2mg/mL). 5.9% of C. albicans strains were susceptible-dose dependent to FLU and 9,8% resistant. Only one sample showed resistance to itraconazol, with CIM 8mg/mL. In the species non-albicans, 11.8% of the isolates were considered resistant to fluconazol and 23.5% to itraconazol.
CONCLUSION: Candida albicans is the most frequent in the vaginal microenviroment, however non-albicans are common vaginal isolates even in a primary care population. The species isolated are less susceptible to fluconazole and itraconazole than most C. albicans, showing the importance of the performance of the identification tests and susceptibility to antifungal agents of vulvovaginal candidiasis.
key words: Candidiasis, Vaginal fluid, Antifungal agents susceptibility



Introdução
A candidíase vulvovaginal (CVV) é a segunda causa mais freqüente de vulvovaginite. Estima-se que 75% das mulheres terão um episódio de CVV ao longo de suas vidas, sendo que 40% a 50% destas teriam a segunda infecção e cerca de 5% poderiam adquirir padrão crônico, com episódios de repetição(6, 16, 17).
Candida spp é responsável por 15% a 25% dos casos de vaginites, sendo causada por isolados que habitam as mucosas vaginal e digestiva e que crescem em meio favorável ao seu desenvolvimento(3, 17)Candida albicansestá presente como microbiota vaginal normal em 15% a 20% das mulheres adultas saudáveis e em 30% a 40% das grávidas(5, 6, 19). Outras espécies como Candida glabrata e Candida parapsilosis podem estar presentes em proporções relativamente menores(2).
Nos Estados Unidos, a incidência de vaginite micótica dobrou entre 1989 e 1990, coincidindo com aumento de 80% no uso de antimicóticos no mesmo período(7). O diagnóstico da CVV deve ser bem estabelecido, com todos os critérios clínicos e exames laboratoriais adequados, para que não ocorram erros e o uso desnecessário de drogas antimicóticas. O autodiagnóstico da CVV, sem exame microscópico e/ou avaliação clínica, dificulta os estudos epidemiológicos e pode induzir resistência do microrganismo ao tratamento convencional.
De modo geral, os estudos demonstram através da cultura do fluido vaginal que Candida albicans está presente em 84% dos casos de CVV, seguida de Candida glabrata (11,7%), Candida tropicalis (5,3%), Candida krusei(2,6%) e outras espécies (2%)(8). Em nosso meio(10), foram observadas prevalências de 86,4% para C. albicans, 4,5% para C. glabrata, 3,9% para Cparapsilosis, 2,7% para C. tropicalis e 1,4% para outras espécies.
O presente estudo tem como objetivo verificar a distribuição de espécies de leveduras causadoras de vaginite e analisar o perfil de sensibilidade das leveduras frente às drogas antifúngicas.

Material e método
Independente de sintomas, foi colhido fluido vaginal de 250 pacientes para a realização de pesquisa direta e isolamento de leveduras através de cultura, no período entre outubro de 2000 e setembro de 2001.
Para pesquisa direta, o esfregaço do fluido vaginal de cada paciente foi corado pelo método de Gram e examinado microscopicamente. Os resultados foram considerados positivos na presença de hifas e/ou blastoconídios. Para isolamento de leveduras, as amostras foram distribuídas em tubos com ágar-Sabouraud e cloranfenicol e incubadas à 25ºC por até 15 dias. As culturas que não apresentaram qualquer crescimento foram consideradas negativas.
Nos casos em que a cultura foi positiva, as colônias foram submetidas a exame microscópico, com solução salina, para confirmação do crescimento de leveduras. Todas aquelas com características macroscópicas diversas foram plaqueadas em meio Chromagar Candida, para isolamento de múltiplas espécies. As colônias com morfologia uniforme foram reisoladas em placas para obtenção de colônias puras e, posteriormente, submetidas às provas para identificação de gênero e espécie, segundo Lacaz et al.(9). As provas foram realizadas com uma cepa controle positivo Candida albicans ATCC 64548.
As espécies consideradas não-C. albicans foram identificadas através de sistema de identificação denominado API-20 C AUX (Bio Meurieux, França).
O uso da técnica de microdiluição permitiu determinar a sensibilidade in vitro de todas as leveduras isoladas aos antifúngicos de uso convencional: fluconazol (Pfizer Laboratórios do Brasil), itraconazol (Janssen-Cilag do Brasil) e anfotericina B (Sigma, Illinois, EUA) utilizando metodologia M-27-A, NCCLS(11) e modificada por Rodriguez-Tudella(14).
As drogas foram conservadas ao abrigo da luz até o momento do uso. Para realização das provas, solução concentrada foi preparada e, com cada solução-mãe, foram feitas dez concentrações decrescentes de antifúngicos, que variaram entre 16µg/ml e 0,03µg/ml para anfotericina B e itraconazol e, de 64 µg/ml a 0,12µg/ml para fluconazol.
A concentração inibitória mínima foi determinada utilizando microplacas de fundo plano, com 96 cavidades distribuídas em oito fileiras de A até H, com 12 cavidades cada uma. Nas colunas de números 2 a 11, foram dispensados 100 µl de cada solução de antifúngico, da maior até a menor concentração. Reservou-se a coluna número 12 para controle positivo de crescimento. Em seguida foram dispensados 200µl do meio nas cavidades da coluna 1, como controle de esterilidade.
O meio de cultura utilizado foi o RPMI 1640 (Sigma, Illinois, EUA) tamponado com ácido morfopropileno sulfônico (MOPS) 1,65M, pH 7,2, acrescido de L-glutamina 200mM e 2% de glicose para otimizar o crescimento do fungo.
Os inóculos foram preparados ressuspendendo, em solução salina esterilizada, colônias com crescimento de 24 horas, em meio de ágar-Sabouraud sem cloranfenicol, feitas de cada uma das amostras. A turbidez foi ajustada para corresponder a 5x10UFC/ml e, após homogeneização, dispensaram-se 100µl da solução nas últimas 11 cavidades de cada fileira. Para controle de qualidade em todas as placas, realizou-se também o ensaio com a cepa-padrão Candida parapsilosis (ATCC 22019). As placas foram devidamente fechadas e, no caso de anfotericina B, embaladas com papel alumínio, para incubação a 37ºC por 24 horas, sob agitação.
A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi feita, após a leitura a 405nm automatizada, por leitor de microplacas (ELISA), da densidade ótica de cada orifício. O aparelho foi programado de forma que considerou a coluna 1 como branco dos reagentes. Considerou-se como controle positivo, com 100% de crescimento, o valor da densidade ótica obtida no orifício número 12.
A CIM para cada droga foi determinada com 80% e 50% de inibição do crescimento. A CIM 80% foi determinada como a menor concentração da droga, com valor de absorbância menor, ou igual, aos 20% do valor lido no orifício 12, ou seja 20% do crescimento encontrado no orifício do controle positivo. A CIM 50% foi calculada de maneira semelhante.
O ponto de corte para determinar isolamentos sensíveis e resistentes foi aquele proposto no documento M27 A, NCCLS(11), considerando a amostra sensível ao fluconazol se CIM < 8µg/ml; com sensibilidade dependente da dose (SDD) se CIM = 16µg/ml ou 32µg/ml; e resistente se CIM > 64µg/ml. Para itraconazol, as amostras foram consideradas sensíveis quando CIM < 0,125µg/mL; com SDD se CIM = 0,25µg/mL ou 0,5µg/mL; e resistente se CIM > 1µg/mL. Para anfotericina B, considerou-se sensível a amostra cujo resultado de CIM foi < 1.

Resultados
Entre as 250 pacientes participantes da pesquisa, 86% estiveram na faixa etária variando de 16 a 45 anos.
Dos 250 esfregaços de fluido vaginal submetidos à coloração de Gram, 42 (16,8%) e 69 (27,6%) entre as culturas foram positivas para leveduras.
A levedura isolada mais freqüente foi Candida albicans (74%), seguida de Candida glabrata em 14,5% das amostras. As outras espécies, Candida tropicalis e Candida parapsilosis, totalizaram oito (11,5%) culturas positivas (Tabela 1).


A CIM foi determinada frente a 68 leveduras isoladas, e os resultados foram avaliados para 50% (IC50) e 80% (IC80) de inibição.
Os 51 isolados de Candida albicans apresentaram os valores de CIM-IC50 variando de 0,12 a 16µg/ml para fluconazol e de 0,03 a 8µg/ml para itraconazol; e de IC80, de 0,25 a 64µg/ml para fluconazol e de 0,03 a 16µg/ml para itraconazol (Tabela 2). No caso de fluconazol, 94,1% dos isolados tinham valores de CIM-IC50entre 0,12 e 8µg/ml e 5,9%, de 16µg/ml, correspondendo ao valor de sensibilidade dependente da dose. No caso de leitura com IC80 observou-se aumento da CIM em 9,8% (= 5) dos isolados, que passaram a ter valor correspondente a resistente (> 32µg/ml) (Figura 1). Em relação ao itraconazol, quando se considerou a IC50,98% das amostras foram sensíveis, e apenas um isolado apresentou CIM de 8µg/ml. Com leitura de IC80, 70,6% foram sensíveis; 11,8%, sensíveis dependendo da dose; e 17,6%, resistentes (Figura 2). Em relação à anfotericina B, os valores de CIM variaram entre 0,12 e 1µg/ml, sendo todas consideradas sensíveis pelos parâmetros atuais (Tabela 2Figura 3).








Os isolados de espécies não-albicans apresentaram valores de CIM para fluconazol entre 0,25 e 64µg/ml para IC50, 0,5 e 64 µg/mL para IC80, e 11,7% dos isolados apresentaram valor de 64µg/ml, considerado resistente, mesmo realizando-se cálculo em IC50. Quando se considerou o IC80, 23,5% dos isolados foram sensível-dependentes da dose, e igual valor apresentou resistência (Figura 4). No caso de itraconazol, os valores das CIMs variaram entre 0,03 e 16µg/ml tanto para IC50 como para IC80. Os valores de CIM entre 0,25 e 0,5µg/ml, considerados sensíveis dependendo da dose, foram observados em 41,2% (n = 7) dos isolados, e 23,5% (n = 4) apresentaram resistência. Quando a IC foi calculada para 80% de inibição, 11,8% dos isolados apresentaram valores sensível-dependentes da dose e 70,6%, resistentes (Figura 5). Os resultados de CIM para anfotericina B variaram entre 0,12 e 2µg/ml, sendo que apenas um isolado apresentou CIM de 2µg/ml (Tabela 3, Figura 6).








Discussão
Candida albicans continua a ser o agente mais prevalente de candidíase vulvovaginal, embora nos últimos anos as espécies denominadas não-albicans tenham se tornado também importantes, principalmente em face dos casos de resistência apresentados por algumas destas(1, 3, 5, 17).
Pizzolito e Mendes-Giannini(13) isolaram de 62 fluidos vaginais de 29 mulheres com CVV: Candida albicans em 87%, seguida de Candida famata (5,5%), Candida glabrata (3,7%) e Candida guilliermondii (3,7%).
Linhares et al.(10) verificaram também que C.albicans foi a levedura mais isolada, seguida por C. glabrata, C.parapsilosis e C. tropicalis em casos de CVV. Otero et al.(12) verificaram que Candida albicans (89,3%) foi a levedura mais isolada de casos de CVV em profissionais do sexo na Espanha.
Xu et al.(20) estudaram leveduras do sistema genitourinário em três grupos de mulheres sem sintomatologia aparente para CVV e verificaram que C. albicans foi a mais prevalente.
Nesta pesquisa, leveduras foram isoladas em 27% das pacientes, independente da presença de sintomas para CVV. Candida albicans foi a levedura mais prevalente (74%), seguida de C. glabrata (14,5%), Candida tropicalis(7,3%) e Candida parapsilosis (4,2%).
Os resultados deste trabalho são concordantes com os resultados das experiências dos autores acima, em queC. albicans continua a ser a levedura mais isolada de CVV, porém, especial atenção deve ser dispensada à presença de C. glabrata em porcentuais maiores que o observado em pesquisas, tanto no Brasil como no exterior. C. albicans ainda é responsável por mais de 90% dos casos de CVV, mas, na última década, um aumento de casos de vaginites por espécies não-albicans foi descrito, e, entre elas, C. glabrata foi a mais comum(4, 15, 18).
O aumento desta levedura, em casos de CVV, pode ser reflexo da realização de culturas e provas de identificação, porém, não se pode descartar a possibilidade de este aumento acontecer em razão do uso de terapias seletivas com doses inadequadas, tanto tópicas quanto sistêmicas, com antimicóticos.
Vários antifúngicos são empregados no tratamento de CVV, e as drogas azólicas se constituem no tratamento de eleição desta doença. No entanto, 5% a 25% das pacientes apresentam recidivas que podem redundar em alguns casos em CVV crônica. O uso de fluconazol de forma profilática em doses baixas para prevenir infecções fúngicas em pacientes imunocomprometidas tem levado à seleção de leveduras da microbiota, fazendo com que apareçam as espécies não-albicans, como C. grablata e C. krusei, ambas resistentes a este antifúngico(15).
Neste trabalho, verificou-se que todos os isolados de C. albicans foram sensíveis a anfotericina B, mas 5,9% apresentaram SDD a fluconazol e 2% de resistência ao itraconazol.
No caso de isolados não-albicans, 11,7% e 23,5% foram resistentes para fluconazol e itraconazol, respectivamente, e um isolado de C. glabrata apresentou CIM de 2µg/ml para anfotericina B. Testes de sensibilidade aos antifúngicos não são solicitados rotineiramente, no entanto, em função do aparecimento de porcentual bastante significativo de leveduras com SDD ou resistentes, sugere-se um programa para o desenvolvimento de testes de sensibilidade para o monitoramento de amostras vaginais, procurando correlacionar estes achados com os achados in vivo.

Agradecimentos
Agradecemos à Dra. Márcia de Souza Carvalho Melhem, a Mônica M. Peria (Instituto Adolfo Lutz/Laboratório Central) e aos funcionários do Laboratório de Micologia da UNESP/campus de Araraquara o apoio técnico.

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