BACTERIOLOGIA E BACTERIOSCOPIA GRAM

DEFINIÇÃO

As bactérias são seres procariontes, isto é, não apresentam envoltório nuclear que delimita o DNA dentro de uma estrutura denominada núcleo. De acordo com a classificação de Robert Whittake em 1969, as bactérias, assim como as cianobactérias (algas azuis) estão incluídas no Reino Monera. Em 2003, Thomas Cavalier-Smith propôs uma nova classificação reconhecendo dois domínios, o domínio Prokaryota, que engloba os reinos Archaea e Bacteria, e o domínio Eukaryota, que envolve tanto os seres unicelulares como pluricelulares.

Assim como qualquer ser vivo, as bactérias possuem papel fundamental no ambiente, na fixação do nitrogênio, fermentação (produção de queijos, iogurtes, etc.), indústria farmacêutica (produção de antibióticos e vitaminas), dentre outros. Nem todas as bactérias são benéficas ao homem. Há uma série de bactérias patogênicas, como exemplo, algumas destas patologia: tuberculose, hanseníase, difteria, coqueluche, pneumonia, meningite meningocócica, tétano, leptospirose, cólera, gonorreia, sífilis, botulismo, febre tifoide, dentre outras.

Características gerais das bactérias:

 • São seres unicelulares, aparentemente simples, sem carioteca, ou seja, sem membrana delimitante do núcleo. Há um único compartimento, o citoplasma.

 • O material hereditário, uma longa molécula de DNA, está enovelada na região, aproximadamente central, sem qualquer separação do resto do conteúdo citoplasmático. Suas paredes celulares, quase sempre, contêm o polissacarídeo complexo peptideoglicano.

 • Usualmente se dividem por fissão binária. Durante este processo, o DNA é duplicado e a célula se divide em duas. A seguir, você irá estudar mais detalhadamente as características de maior importância para o entendimento das aulas seguintes.

Tipos de bactérias

A maioria das bactérias são heterotróficas, isto é, não conseguem produzir sua própria comida e precisam obtê-la no ambiente ou em outros organismos. Existem também bactérias autotróficas, que conseguem produzir sua própria comida, geralmente por meio da fotossíntese.

O método mais simples de classificação das bactérias é através da seu formato. Existem 3 grandes grupos:

1.) Cocos: bactérias em formato esférico que apresentam tendência a se agrupar.

Existem diferentes gêneros de cocos, classificados de acordo com a forma que se agrupam. Quando os cocos se agrupam em pares damos o nome dediplococos; os cocos do gênero Estafilococos (Staphylococcus) se agrupam em cachos; Estreptococos (Streptococcus) são um gênero de cocos que geralmente se agrupam em fileira.

Os cocos são responsáveis por uma grande variedade de doenças, algumas delas já abordadas em outros textos deste site, como:

a) Neisseria gonorrhoeae: bactéria causadora da gonorreia
b) Neisseria meningitidis: bactéria causadora de meningite

c) Streptococcus pneumoniae: bactéria causadora de pneumonia
d) Streptococcus pyogenes: bactéria causadora da amigdalite, escarlatina e febre reumática.
e) Streptococcus viridans: bactéria causadora da endocardite infecciosa.
f) Streptococcus agalactiae: bactéria causadora de infecção neonatal.
g) Staphylococcus aureus: bactéria causadora de várias infecções, geralmente iniciadas na pele, como a celulite e infecções  multirresistentes

2.) Bacilos ou bastonetes: bactérias em formato de bastão. Podem ou não possuir flagelos que as ajudam a se locomover. Exemplos de bacilos patogênicos são o Bacillus anthracis, causador do antrax,Corynebacterium diphteriaecausador da difteria e aSalmonella typhi, causadora da febre tifóide.

3.) Espiraladas: são bactérias em forma de espiral, geralmente dividas em 2 grupos: espirilos e espiroquetas. Entre as espiroquetas, a mais comum é oTreponema pallidum, causador da sífilis

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Bactérias aeróbias e anaeróbias.

 O primeiro grupo consiste em bactérias que precisam de oxigênio para viver; o segundo são aquelas que não conseguem sobreviver em ambientes com oxigênio. Há ainda as bactérias anaeróbias facultativas, que podem viver tanto em ambientes oxigenados ou não.

Exemplos de descrição de bactérias:

– Shigella sonnei: bastonete gram negativo, aeróbico, não flagelado, causador de infecções intestinais
– Streptococcus pneumoniae diplococo gram positivo, anaeróbico facultativo, não flagelado, causador de pneumonia, sinusite, meningite e otite
– Vibrio cholerae: Vibrião gram negativo, flagelado, anaeróbico facultativo, causador da cólera

Basear-se somente na forma pode causar muita confusão. Por isso, existem vários outros modos de se classificar e caracterizar as bactérias; um exemplo é método de Gram.

Coloração simples com corantes básicos.

 A coloração de células mortas é preferível às preparações a fresco, pois os corantes reagem quimicamente com as células bacterianas, e não interferem com o meio circundante, permitindo identificar estruturas internas e tirar maior partido da objetiva de imersão.

Na microbiologia, é imprescindível que conheçamos a técnica de coloração de Gram, assim como o mecanismo da mesma, para a correta interpretação da bacterioscopia. Obviamente, além dos materiais como corantes e bico de Busen, é de extrema importância que a coloração seja de qualidade, para a obtenção de um resultado confiável e que de fato auxilie na identificação do microrganismo.

A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christi an Gram. Ela é um dos processos de coloração mais úteis, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas (que coram em roxo) e gram-negativas (coram em rosa). Tal reação à coloração de Gram se deve às diferenças na estrutura da parede celular de células gram-positivas e gram-negativas, que permitem que o álcool descore as células gram-negati vas, mas não as gram-positivas. Os diferentes tipos de bactérias reagem de modo diferente à coloração de Gram, provavelmente porque diferenças estruturais em suas paredes celulares (Figura 1) afetam a retenção ou liberação de uma

O mecanismo da coloração de Gram se refere à composição da parede celular, sendo que as Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e ácido teicóico, e as Gram-negativas, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool-acetona extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas.

    Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CVI) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular das bactérias gram-positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool-acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CVI não pode ser extraído.

    Outra explicação

Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. Nas Gram-positivas, o complexo CVI é retido na parede após tratamento pelo álcool-acetona, o que causa, provavelmente, uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de glicopeptídeo ou peptideoglicano da parede celular. A parede das bactérias Gram-negativas permanece com porosidade suficientemente grande, mesmo depois do tratamento com álcool acetona, possibilitando a extração do complexo CV-l.

A partir de então, pode-se classificar as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas.

      Gram-positivas: são bactérias que possuem uma espessa camada de peptideoglicano e ácido teicóico e que, portanto, coram-se de azul.

      Gram-negativas: são bactérias que possuem uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos. Estas bactérias coram-se de vermelho.

Desde o trabalho original de Hans Gram, vários pesquisadores tentaram, com pouco sucesso, determinar o mecanismo envolvido no método de coloração. Conceitos diversos têm sido apresentados, tais como: i) A existência de um substrato Gram-positivo e específico; ii)As bactérias Gram-positivas e Gram-negativas possuiriam diferentes afinidades com o corante primário cristal de violeta; e iii) A existência de diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos. Este último é o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da parede celular, quanto as dimensões dos espaços intersticiais, por exemplo, “diâmetro do poro”, parecem ser determinantes do resultado final da coloração de Gram.

Procedimento

1. Cubra o esfregaço com cristal violeta e deixe por aproximadamente 1 minuto;

2. Escorra o corante e lave em um filete de água corrente;

3. Cubra a lâmina com lugol e deixe agir por aproximadamente 1 minuto;

4. Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente;

5. Adicione álcool-acetona sobre a lâmina; descorando-a, até que não desprenda mais corante;

6. Lave em um filete de água corrente;

7. Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos;

8. Lave em um filete de água corrente;

9. Deixe secar ao ar livre;

10. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço;

11. Leia em objetiva de imersão (100 X).

Interpretação do resultado:

Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool-acetona extrai os lipídeos, resultando na porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias gram-negativas. Por este motivo, o cristal violeta aplicado no início do processo sai, e a safranina aplicada ao final permanece. As gram-negativas coram-se então devermelho (ou rosa).

Em contrapartida, a parede celular das bactérias gram-positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool-acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida. Sendo assim, essas bactérias retém o cristal violeta e não se descoram com a aplicação do álcool. As gram-positivas coram-se então de azul (ou roxo).  

Como agem patogenicamente as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas?

As bactérias agem patogenicamente por meio de toxinas. As toxinas das bactérias patogênicas são substâncias que causam danos aos tecidos animais. Elas são de dois tipos: endotoxinas e exotoxinas. Ambas alteram ometabolismo normal das células ou dos tecidos do hospedeiro, danificando-os. As endotoxinas secretadas pelas bactérias Gram-negativas geralmente estão ligadas à membrana externa da parede da célula, só sendo liberadas após destruição das mesmas. Quando ocorre o rompimento da célula bacteriana e liberação da toxina, há uma resposta do sistema imune que, em geral, causa febre, dores, choques e vasodilatação. Em grandes quantidades, a toxina pode levar à septicemia e à morte. Quando a infecção é causada por uma bactéria Gram-positiva, atoxina liberada na corrente sanguínea pela parede bacteriana tem efeito semelhante à provocada pelasendo

toxinas. Entre elas estão as infecções de maior virulência, como a toxina diftérica, a toxina colérica, a toxinabotulínica, a toxina tetânica, a toxina pertussis, etc

Alguns exemplos de micro-organismos Gram-positivos e Gram-negativos

• Gram-positivos: Stafilococcus aureus, Lactobacillus spp, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Clostridium tetani e Enterococcus faecalis.
• Gram-negativos: Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Vibrio colerae, Treponema pallidum, Salmonella, Shigella

Bactéria Salmonella	Morfologia Bacilo	Doença Patologias como gastroenterite, septicémia, febre entérica causam os sintomas da salmonelose. Gastroenterite: salmonelose mais frequente, a sua sintomatologia surge 6 a 48h após ingestão de alimentos ou água contaminados; os sintomas mais comuns são: diarreia não sanguinolenta, náuseas, dores abdominais tipo cólica e cefaleias. É autolimitada, durando de 2 dias até 1 semana. Septicemia: Todas as espécies de Salmonella podem causar bacteriémia, mas em particular os sorovares, Salmonella Choleraesuis, Salmonella Paratyphi e Salmonella Typhi; como grupos de risco, encontram-se crianças, idosos, e indivíduos seropositivos; Febre entérica, vulgarmente conhecida por febre tifóide (diferente do tifo), infecção sistémica febril caracterizada por febre gradual constante 10 a 14 dias após a infecção. Resulta especialmente de Salmonella Typhi, boa produtora de antígeno Vi. Agentes bacterianos: Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi. e	Profilaxia Lavar frequentemente as mãos; Evitar alimentos crus ou mal cozidos (ex. ovos, frutas, peixes, palmitos); Correta pasteurização do leite e cocção de outros produtos como azeitonas, palmitos, etc. Controle de pragas urbanas, especialmente ratos, baratas e formigas, uma vez que frequentam esgotos e podem veicular mecanicamente sorotipos de Salmonella para os alimentos	Coloração Gran-negativa
Shigella	Bastonete	Disenteria	Higienização	Gram negativa
Haemophilus influenza	bacilo	Pode provocar meningites, infecções no ouvido médio (Otite média) e respiratórias (faringite, bronquite ou pneumonia). Raramente pode causar também infecções generalizadas (sépsis), epiglotite, osteomielite e artrite séptica.	Vacinação	Gram negativa
Chlamydia trachomatis	Bastonete	Tracoma, clamidiase	Prevenção de DST	Gram negativa
Pseudomonas aeruginosa	Bacilo	Patogênico de indivíduos com sistema imunológico comprometido, a P. aeruginosa normalmente infecta o aparelho respiratório, aparelho urinário, queimaduras, e também causa outras infecções sanguíneas	Higienização em locais contaminados e ambientes hospitalares	Gram negativa
Treponema pallidum	Espiroquetas	Sífilis	Prevenção de DST	GRAM NEGATIVA
Vibrio cholerae	vibrião	cólera	A principal característica do V. cholerae é sua capacidade de produzir uma potente enterotoxina, cujo exato mecanismo de ação é ainda desconhecido. Estudos indicaram que uma cepa defectiva na produção desta toxina poderia ser utilizada na produção de vacinas; entretanto, em estudos com voluntários estas cepas foram capazes de produzir diarréia, levando a crer que o V. cholerae produz outras toxinas	Gram negativa
Neisseria meningitidis e Neisseria gonorrhoeae	cocos	Meningite e Gonorreia	Combater baixa imunológica, Prevenção de DST	Gram negativa
Escherichia coli	Enterobacteria	Infecções bacteriana variadas	O E. coli é transmitido por via oro-fecal a seres humanos e outros animais, geralmente por[7]: Consumir água sem tratamento de esgoto; Carne não cozida a mais de 71°C; Leite ou queijos não-pasteurizados; Vegetais e legumes regados com água contaminada e mal lavados. Nadar em rios, lagos ou piscinas contaminados; Contato direto com o ambiente de animais infectados	Gran-negativa
Brucella abortus	cocos	brucelose	Higiene alimentas	Gram negativa
Rickettsia typhi	cocos	Tifo murino ou tifo endêmico	O termo murino refere-se ao fato de que animais do gênero mus, como ratos, são vetores da pulga que transmite a bactéria dessa tifo. Endêmico se refere a seu caráter mais local, em oposição a epidêmico que é mais generalizado, apesar disso ocorrem casos em todos os continentes (exceto Antártida).	Gram-negativo

São exemplos de bactérias Gram-positivas várias espécies de:
- Estreptococos;
- Estafilococos;
- Enterococos.

Entre a grande variedade de doenças provocadas por cocos salientam-se:
- Pneumonia nosocomial (adquirida em meio hospitalar);
- Pneumonia adquirida na comunidade;
- Infecções da pele e tecidos moles.

Estreptococos

        Estas bactérias Gram-positivas crescem em cadeias, de comprimento variável, e são responsáveis por muitas infecções distintas. Embora classificadas como aeróbias, a maioria são anaeróbias facultativas (capazes de crescer num leque alargado de concentração de oxigênio), enquanto que poucas são anaeróbias obrigatórias.

As infecções causadas por Estreptococos:
- Meningite bacteriana
- Pneumonia (adquirida na comunidade ou nosocomial)    
- Otite média: o Streptococcus pneumoniae é responsável por 20% a 50% dos casos
- Sinusite
- Bronquite  
- Menos freqüentemente, endocardite (menos de 3% dos casos são causados por S. pneumoniae)
- Também menos freqüentemente, peritonite, artrite séptica, infecções pélvicas e infecções de tecidos moles. Os pneumococos podem causar estas infecções sobretudo em doentes com doenças subjacentes.


Estafilococos

        Estas bactérias estão entre as bactérias mais resistentes que não formam esporos e podem sobreviver em muitas situações não fisiológicas. Normalmente, colonizam a pele e encontram-se nas narinas e na pele de 20% a 30% dos adultos saudáveis.

        Podem também encontrar-se (embora menos freqüentemente) na boca, glândulas mamárias e tratos genito-urinário, intestinal e respiratório superior.

        As infecções por estafilococos são freqüentemente supurativas (com produção de pus) e têm sido implicadas em muitos tipos diferentes de infecções, incluindo pneumonia, meningite, osteomielite e infecções da pele e tecidos moles.

Enterococos

        Estes cocos, antes classificados como estreptococos do Grupo D, ocorrem em cocos individuais, aos pares e em cadeias curtas.

        São anaeróbios facultativos, que podem crescer em condições extremas e numa grande variedade de meios, incluindo solo, alimentos, água e em muitos animais. O seu principal habitat natural parece ser o tubo digestivo dos animais, incluindo o do homem, onde representam uma porção significativa da flora normal. Podem também encontrar-se, em menor número, nas secreções orofaríngeas e vaginais.

        Por viver mais tempo na água do mar do que os coliformes, o enterococos é considerado pela Agência de Proteção ao Meio Ambiente dos Estados Unidos um indicador mais preciso de doenças transmitidas pelo contato com a água.

        As infecções por enterococos ocorrem em doentes internados, freqüentemente após cirurgia ou instrumentação (por exemplo, algaliação). Os enterococos podem causar superinfecções em doentes internados, sob terapêutica antibiótica.

        A superinfecção pode ocorrer quando os antibióticos alteram o equilíbrio bacteriano no organismo, permitindo o crescimento dos agentes oportunistas, como o enterococos. A superinfecção pode ser muito difícil de tratar, porque é necessário optar por antibióticos eficazes contra todos os agentes que podem causá-la.

As infecções por enterococos incluem:
- Infecções urinárias           
- Infecções de queimaduras e feridas cirúrgicas           
- Bacteremia           
- Endocardite           
- Infecções intra-abdominais e pélvicas (estas infecções são habitualmente mistas, causadas por enterococos e outros agentes patogênicos)           
- Infecções de feridas e dos tecidos moles           
- Sépsis neonatal           
- Meningite (raro).

        As bactérias possuem grande importância ecológica, elas fixam o nitrogênio da atmosfera na forma de nitratos, e as bactérias desnitrificantes que devolvem o nitrogênio dos nitratos e da amônia para a atmosfera. As bactérias também são úteis para o homem, como na indústria de laticínios e na indústria farmacêutica que utiliza bactérias para fabricar antibióticos específicos.

        De outra maneira as bactérias podem causar grandes prejuízos econômicos, como é o caso do amarelinho (Xylella fastidiosa), que ataca a lavoura da laranja. Mas talvez a maior importância das bactérias seja o fato delas serem parasitas humanos, levando a infecções muito graves. Assim temos o gênero Clostridium que além de esporulado é aneróbio e um potente produtor de toxinas muito prejudiciais ao homem. Seus esporos podem estar presentes em alimentos e resistir a processos de descontaminação podendo causar graves intoxicações como o botulismo (agente Clostridium botulinum), em função da ação neurotóxica de suas toxinas.

        Geralmente estão associados a intoxicações por ingestão de palmitos contaminados e podem levar a óbito. É desse grupo também o produtor da toxina tetânica, que provoca o tétano (Clostridium tetani). O esporo contamina o ferimento profundo que ao fechar gera uma atmosfera com baixa tensão de oxigênio, levando a germinação, produção de toxina, e, finalmente a tetania. A Escherichia coli é um importante componente da nossa microbiota intestinal, no entanto, fora do intestino pode causar importantes e graves infecções, principalmente nas vias urinárias

FONTE: TRABALHO DE MICROBIOLOGIA DA AULA ALCILAINE FRANCO DE ASSUNÇÃO