Auditory hypersensitivity in children and teenagers with autistic spectrum disorder

Hipersensibilidade auditiva em crianças e adolescentes com transtorno do espectro autista

Erissandra Gomes^I; Newra T. Rotta^II; Fleming S. Pedroso^III; Pricila Sleifer^IV; Marlene C. Danesi^V

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre RS, Brazil (UFRS):
^IMaster in Medical Sciences: Pediatrics, Phonoaudiology Professor, Rede Metodista IPA, Porto Alegre RS, Brazil (IPA)
^IIPostdoctorship in Neurology, Pediatrics Department, UFRS
^IIIDoctor in Pediatrics, Pediatrics Professor, Universidade Federal de Santa Maria, Neurology Professor - IPA
^IVSpecialist, Phonoaudiology Professor, Audiology Department - Rede Metodista IPA
^VMaster in Problems and Pathologies of Disability, Phonoaudiology Professor, IPA.Grant by CAPES

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ABSTRACT

OBJECTIVE: To verify if the clinical behavior of auditory hypersensitivity, reported in interviews with parents/caregivers and therapists/teachers of 46 children and teenagers suffering from autistic spectrum disorder, correspond to audiological findings.
METHOD: The clinical diagnosis for auditory hypersensitivity was investigated by means of an interview. Subsequently, a test of the acoustic stapedial reflex was conducted, and responses to intense acoustic stimulus in open field were observed.
RESULTS: Of the 46 subjects, 11 (23.9%) were clinically diagnosed as oversensitive to sound and only 2 showed discomfort when exposed to intense acoustic stimulus in open field. There was no statistically significant difference for the test of the ipsilateral acoustic stapedial reflex between the groups.
CONCLUSION: Behavioral manifestations to sounds are not associated to hypersensitivity of the auditory pathways, but instead these are associated to difficulties in the upper processing, involving systems that usually are impaired in autistic spectrum patients, such as the limbic system.

Key words: autism, hypersensitivity, sound.

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RESUMO

OBJETIVO: Verificar se o comportamento clínico de hipersensibilidade auditiva, relatado nas entrevistas com os pais/cuidadores e terapeutas/professores de crianças e adolescentes com transtorno do espectro autista, corresponde aos achados audiológicos.
MÉTODO: O diagnóstico clínico para a hipersensibilidade auditiva foi investigado a partir do protocolo de entrevista. Após, foi utilizada a pesquisa do reflexo acústico estapédico e observadas as reações ao estímulo sonoro intenso em campo aberto.
RESULTADOS: Dos 46 sujeitos, 11 (23,9%) foram diagnosticados clinicamente como hipersensíveis ao som, e somente 2 demonstraram desconforto quando expostos ao estímulo sonoro intenso em campo aberto. Não houve diferença estatisticamente significante para a pesquisa do reflexo acústico estapédico ipsilateral entre os grupos.
CONCLUSÃO: As manifestações comportamentais aos sons não estão associadas à hipersensibilidade das vias auditivas, mas, sim, a dificuldades no processamento superior, envolvendo sistemas que comumente estão comprometidos nos pacientes do espectro autista, como o sistema límbico.

Palavras-chave: autismo, hipersensibilidade, som.

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Leo Kanner was the first to describe a group of children suffering from autistic disturbances of affective contact, refered to the pattern of relationship among these children. The author also reported in his first description of autistic children the aversion some of these feeling towards certain sounds¹. The current trend is to consider the continuum or spectrum, which includes autism as described by Kanner, but not only this, referring to three impairments - social interaction, communication, and imagination, which are related to each one dependently^2-5. The autistic spectrum disorder includes, in addition to classic autism, Asperger's syndrome and pervasive developmental disorder not otherwise specified^6-8. Autistic patients may present a change in the response to sensations, which is described as a sensory defense to tactile modalities (high sensitivity to touch or textures), as well as oral, visual (high sensitivity to light), and, mainly, acoustic modalities through a peculiar sensitivity to sounds ^5,9-11. Specifically concerning hypersensitivity to sounds, it is known that the terms auditory hypersensitivity, audiosensitivity, phonophobia, hyperacusis, and decreased tolerance to sounds have been used as synonyms in similar contexts^12,13. Some authors report that auditory hypersensitivity may appear in three ways: hyperacusis, phonophobia, and increased dysacusis^12,14-16. The pathogenesis of auditory hypersensitivity is still unknown, with several potential causes existing^13,17-19.

Autistic individuals are hard to evaluate by means of subjective tests. The clinical use of otoacoustic emissions in autistic children is a non-invasive, objective method, which is accurate in respect to the level of stimulation and frequency aimed in assessing the peripheral auditory system in patients presenting unusual responses to audiometric procedures as a consequence of their behavioral and interactive characteristics^20-26. The study of the acoustic stapedial reflex is also suitable for hard-to-test patients, as it leads to objective results^24-27. The loudness discomfort level test is used as an audiologic test to detect hypersensitivity, since it is a method usually utilized to determine the level of tolerance to intense sound^13,18.

The purpose of this study was to verify if the clinical behavior of auditory hypersensitivity, reported in interviews with parents/caregivers and therapists/teachers of children and teenagers with autistic spectrum disorder, corresponds to the audiologic findings (test of acoustic stapedial reflex and observed responses to intense acoustic stimulus in open field) and ascertain, if other types of stimuli lead to oversensitive responses as well.

METHOD

Population under study - Children and teenagers with autistic spectrum disorder, who regularly came for clinical care at the IPA Clinic; clinical and pedagogical care at Teach Novo Horizonte Center, at Kinder and CADEP's Autism Nucleus; and pedagogical assistance at Lucena Borges Municipal School. The subjects of this population were subjected to clinical and/or pedagogical follow-up at the institutions they belonged to. Inclusion criteria - every child and teenager at ages ranging from 5 to 20 years who attended the aforementioned institutions and fit in the autistic spectrum disorder according to DSM IV criteria. Exclusion criteria - children and teenagers with autistic spectrum disorder whose parents didn't sign the consent form; those whose audiological evaluation showed signs indicative of hearing loss; and those who didn't complete all evaluations.

Data collection was carried out by examination procedures. All children and teenagers in the sample were evaluated by the assistant neurologist, who in agreement with the therapist confirmed the autistic spectrum disorder diagnosis. After confirmation of the diagnosis, the children and teenagers were evaluated by the same phonoaudiologist at IPA Clinic, specialized in audiology, with the purpose of excluding the ones suffering from hearing loss and evaluating the audiological findings. Distortion-product otoacoustic emissions were carried out in an acoustic booth, with internal noise lower than 30dB, using the Hort Mann-Neuro-Otometrie software (made in the USA), connected to an AmDis-OEA software and a microphone-probe, which is inserted into the external acoustic meatus by means of a flexible rubber (used to seal the external acoustic meatus). For the measurements of acoustic immittance, the Impedance Audiometer AT22 t (Interacoustics, Germany) was used, and the acoustic stapedial reflexes were studied at frequencies of 500Hz, 1000Hz, 2000Hz and 4000Hz in both ears, with final recording at dBNPS. For the study of observed responses to intense acoustic stimulus in open field, the Clinical Audiometer AC30 (Interacoustics, Germany) was used. The acoustic stimulus used was a warble at a 90dB mean intensity, between frequencies of 500Hz to 6000Hz, conducted in an acoustic booth, in which the stimulus was emitted by an Interaudio 1000XL speaker (made in Ireland). All equipment was properly calibrated.

The diagnosis for auditory hypersensitivity, by means of the clinical characteristics for this event, was investigated using an interview with parents/caregivers and the procedure for auditory hypersensitivity aimed at therapists/teachers, which were conducted in the clinical-therapeutic setting of every child. The work was overseen by the supervisor and co-supervisor.

The statistic program used for the analyses was SPSS (version 11.0). Analyses of frequency were performed, the mean and standard-deviation were calculated, and Fisher's exact test and the Kappa coefficient were used. The estimated rates of hypersensitivity were achieved by the calculation of the 95% confidence interval. The significance level was set at 5% (a=0.05).

Ethic aspects - The responsible for the institutions involved in the study signed a consent form. The parents and/or responsible were properly enlightened as to the study goals, and only the cases in which these signed informed consent form were included. This project was approved by the IPA College Ethics Committee and by the Committee of Research and Ethics in Health of Hospital de Clínicas de Porto Alegre.

RESULTS

The data from 46 children and teenagers with autistic spectrum disorder that attended different institutions in Porto Alegre were analyzed. Of these, 39 (84.8%) were males. Ages range was 5 to 19 years (mean age 10.85 years). As regards therapeutic support, 30 (65.2%) were undergoing phonoaudiological treatment, 8 (17.4%) physiotherapeutic treatment, 3 (6.5%) psychological treatment, 4 (8.7%) psychiatric treatment, 12 (26.1%) occupational therapy, and 5 (10.9%) were undergoing other types of treatment.

As for hypersensitivity, 11 were oversensitive to sound, 6 oversensitive to light, and 11 oversensitive to touch (Table 1). In this sample, there was a report on insensitivity to pain in 19 cases (41.3%).

Seeking a correlation between the different types of sensoriperceptual abnormalities, no correlation of hypersensitivity to sound with the other types of hypersensitivity was observed (Table 2). Only a correlation between abnormal response to light and touch occurred.

Of the 46 subjects, 11 (23.9%) are literate, and 28 (60.9%) possess verbal language. Of the 11 literate subjects, 4 (36.4%) are oversensitive to sound, while among the 35 illiterate, 7 (20.0%) are oversensitive to sound. Of the 28 presenting verbal language, 8 (28.6%) are oversensitive to sound, and of the 18 without verbal language, 3 (16.7%) are oversensitive to the same stimulus.

Among the 11 oversensitive to sound, 2 (18.2%) demonstrated discomfort when exposed to intense acoustic stimulus in open field; however, of the 35 remaining, none demonstrated a discomfort response. Such findings show a borderline significance (p=0.053). Of the 11 subjects that were oversensitive to sound, 10 (91%) showed the associated motions of putting their hands on the ears, and of the 35 non-oversensitive, only 2 (5.7%) performed this movement (p<0.001).

The results from the ipsilateral acoustic stapedial reflex test are shown in Table 3.

DISCUSSION

There was been several reports highlighting abnormal responses to sensoriperceptual stimuli, such as visual, tactile, smell-related, taste-related and, most notably, auditory stimuli^5,10,11,28. The findings from our study showed a prevalence of hypersensitivity to sound and touch. Regarding the auditory aspect, the rate of hypersensitivity to sound disclosed in this study was 23.9%, considering this a clinical characteristic described by parents/caregivers and therapists/teachers. This result is in agreement with the findings of literature that use the clinical method is refered as seing a common feature to children and teenagers with autistic spectrum disorder ranging from 15% to 40%^21,22. Although these results are widely mentioned, few one studies are concerned to reporting rates.

Of the 11 children and teenagers clinically diagnosed as hypersensitive to sound, only 2 showed discomfort when exposed to intense acoustic stimulus in open field (90dB - warble). The statistic significance for this datum was borderline. The only study available for discussion was the one that identified 18% as oversensitive to a 70db click stimulus²⁰. The borderline significance suggests that perhaps this difference really may be achieved in a larger number of cases. The observation of behavioral responses to intense acoustic stimulus in open field was the method used to determine the tolerance to the respective stimulus, since the use of the loudness discomfort level test is not feasible in autistic patients as it demands patient collaboration^13,18.

In this study, there was no difference between the 2 groups studied when the results from the test of the ipsilateral acoustic stapedial reflex were analyzed. The studies dealing with hypersensitivity to sound in children and teenagers with autistic spectrum disorder suggest that there is some difference between patients and controls, but the authors themselves point out to the fact that the difference is not significant^13,18,29. It urges to underscore the importance of this test for autistic children and teenagers, as it is an objective test indicated for patients that usually are hardly to be tested. The use of the acoustic stapedial reflex test for hyperacusic patients, when differentiating these from the ones with phonophobia, has been criticized. Hyperacusis is an abnormal response that occurs in the auditory pathways as a result from exposure to a certain sound level, which causes reduction in the tolerance thereof, whereas phonophobia is an abnormal response from the limbic and autonomic systems, without auditory abnormality, but originating from an increase in the connections between the auditory and limbic systems¹⁶.

Usually the emotional factor can magnify the global stimulation and cause, in some person, an enhancement in the perception of visual, auditory, smell and/or painful stimuli. Hypersensitivity involves the limbic system, and this system usually shows abnormalities in autistic subjects. When a sound elicits abnormal responses, the result is the establishment of a subconscious reflex response with automatic and invariable activation of the limbic and autonomic nervous systems. With respect to the pathophysiological mechanism of hearing, the conscious perception of sound occurs only when the stimulus reaches the auditory cortex; however, the perception of intensity is not defined by sound intensity, but also by its meaning and associations^15,30.

The correlation observed between hypersensitivity to sound and the motions of placing the hands on the ears may result from the stimulation of the autonomic nervous system and the triggering of protective reflexes. There is a link between perceptual abnormalities and behaviors of stereotypy, fixations, and obsessions⁹.

The results from this study show that the behavioral manifestations to sounds are not associated to hypersensitivity of the auditory pathways, but rather to difficulties in the upper processing at the level of the cerebral cortex, involving systems that usually are impaired in autistic spectrum patients, such as the limbic system. Identical results occur with other changes in sensitivity and their associated behaviors, as fear and reality distortions, which are complex interactions originated from upper processings, instead of specific hypersensitive pathways.

Acknowledgments - We would like to thank the following institutions for their collaboration with the study: IPA Clinic, Teach Novo Horizonte Center, Kinder, CADEP Autism Nucleus, and Lucena Borges Municipal School.

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Dra. Erissandra Gomes - Rua Duque de Caxias 955/406 - 90010-282 Porto Alegre RS - Brasil. E-mail:erifono@hotmail.com

Efeito da mitomicina C em cultura de estroma de pólipos nasais eosinofílicos: indução de apoptose em eosinófilos

Effect of mitomicin C in eosinofilic nasal polyps estromal culture: induction of apoptosis in eosinophil

Paulo Fernando Tormin Borges Crosara^I; Evaldo Nascimento^II; Sebastião C. Sobrinho^III; Anilton C. Vasconcelos^IV; Roberto E. S. Guimarães^III; Helena M.G. Becker^III; Enrico A. Calosimo^V; Flávio B. Nunes^VI

^IDoutor pelo Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Fonoaudiologia da Universidade Federal de Minas Gerais
^IIProfessor Adjunto do Departamento de Parasitologia da Universidade Federal de Minas Gerais
^IIIProfessor Adjunto do Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Fonoaudiologia da Universidade Federal de Minas Gerais
^IVProfessor Adjunto do Departamento de Patologia Geral da Universidade Federal de Minas Gerais
^VProfessor Adjunto do Departamento de Estatística da Universidade Federal de Minas Gerais
^VIPós-graduando, nível doutorado pelo Departamento de Cirurgia Geral da Universidade Federal de Minas Gerais

Endereço para correspondência

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RESUMO

A polipose nasossinusal eosinofílica é uma afecção comum a várias doenças, determina acometimento extenso dosseios paranasais e possui grande tendência à recidiva após tratamento. Os eosinófilos exercem papel essencial na patogênese, relacionada a baixo índice de apoptose e a longa permanência destas células ativas nos tecidos.
OBJETIVO: Este estudo teve por objetivo avaliar o efeito da mitomicina C na indução de apoptose em eosinófilos presentes no estroma de pólipos nasais eosinofílicos.
FORMA DE ESTUDO: Caso controle.
MATERIAL E MÉTODO: O estudo foi auto-pareado, com 9 amostras cultivadas em meio RPMI 1640 e avaliadas em zero, 12 e 24 horas. O grupo estudo recebeu mitomicina C numa concentração de 400µg/ml durante 5 minutos. Em cada tempo as duas culturas, controle e estudo, foram submetidas a estudo histopatológico para determinação do índice apoptótico. Utilizou-se a coloração hematoxilina-eosina com aumento microscópico de 1000x.
RESULTADO: Pela análise de 674 campos digitalizados observou-se que as culturas tratadas com mitomicina C apresentaram índice apoptótico em 12 horas significativamente maior em relação ao grupo controle (p< 0,001).
CONCLUSÃO: Concluiu-se que a mitomicina C é eficaz na indução de apoptose em eosinófilos presentes em estroma de pólipos nasais eosinofílicos.

Palavras-chave: polipose nasossinusal, eosinófilos, mitomicina C, apoptose.

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SUMMARY

The eosinophilic nasal polyposis occurs as a manifestation of several diseases. It affects multiple nasal sinuses and presents with high relapsing rates after current treatment. The eosinophils play an essencial role in the pathogenesis through their low apoptosis rates and the long periods of remaining in the tissues in an active form.
AIM: During the present study the effect of C-mitomycin was observed in the apoptosis induction of stromal eosinophils in eosinophilic nasal polyps.
STUDY DESIGN: Case control.
MATERIALS AND METHOD: During this auto-matched study, 9 samples of eosinophilic nasal polyps were cultivated in RPMI 1640 medium and then evaluated at the beginning, and after 12 and 24 hours of incubation. The study group was submitted to C-mitomycin in a 400 µg/ml concentration during 5 minutes. Both control and study group cultures were evaluated histopathologically and their apoptotic rates were determined. They were stained using hematoxilin-eosin and observed through microscopic enhancement of 1000 times.
RESULTS: The analysis of 674 digitalized fields showed that those cultures treated with C-mitomycin achieved significantly higher apoptotic rate after 12 hours of incubation when compared to control group rate (p<0,001).
CONCLUSION: This study supports that C-mitomycin is efficacious in the induction of the apoptosis of stromal eosinophils in eosinophilic nasal polyps.

Key words: nasal polyps, eosinophils, mitomycin C, apoptosis.

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INTRODUÇÃO

A polipose nasossinusal (PNS) caracteriza-se pela presença de pólipos nasais múltiplos, comumente bilaterais, decorrentes de processo inflamatório da mucosa nasossinusal. Histologicamente, os pólipos nasais podem ser classificados em eosinofílicos e não eosinofílicos. A PNS eosinofílica representa 80 a 90% das PNS, associa-se à hiper-reatividade nasal e/ou brônquica e responde bem à corticoterapia. Engloba pacientes com diferentes fatores etiológicos e evoluções clínicas em relação às vias aéreas superiores e inferiores. A PNS eosinofílica é encontrada na Rinite Eosinofílica Não Alérgica (NARES), na Intolerância Aspirínica, na Atopia, na Sinusite Fúngica Alérgica e na Síndrome de Churg Strauss^1,2,3

A infiltração dos pólipos pelos eosinófilos é a característica mais marcante da PNS eosinofílica, sendo o gatilho para se tentar compreender a patogênese desta afecção. A eosinofilia tecidual pode ser explicada pelo aumento da migração de eosinófilos para o local do processo inflamatório e/ou pelo aumento da sobrevida destes eosinófilos no tecido, conseqüente ao retardo no processo de apoptose.⁴

O termo apoptose, ou morte celular programada, refere-se ao processo não-patológico de morte celular. Caracteriza-se por uma seqüência de eventos distintos da necrose, impedindo a liberação de constituintes internos da célula e a ativação de mediadores da inflamação.⁵

Sabe-se que a apoptose é um processo ativo dependente de RNA e síntese protéica. Simon et al. (1997)⁶demonstraram que o fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos (GM-CSF) e a interleucina 5 (IL-5), produzidos por eosinófilos e linfócitos^7,8, têm capacidade de prolongar a sobrevida dos próprios eosinófilos, porinibição da apoptose.

Bjornson, Harvey e Rose (1985)⁹ demonstraram que a hidrocortisona pode suprimir, por ação direta sobre as células, a formação de colônias de eosinófilos. Liles, Dale e Klebanoff (1995)¹⁰ e Meagher et al. (1996)⁵demonstraram a existência de efeito contrário dos corticosteróides sobre os eosinófilos e neutrófilos. Haveria aumento do número de neutrófilos conseqüente à redução da taxa de apoptose.^11,12

O receptor Fas (CD 95/APO1), membro da superfamília TNF/NGF (Fator de Crescimento Neural), parece induzir apoptose nos eosinófilos. Sua ativação nos eosinófilos de indivíduos normais conduz rapidamente à apoptose. Em contrapartida, eosinófilos de indivíduos eosinofílicos não sofrem apoptose, mesmo que o receptor Fas ativo seja expresso normalmente nestas células.¹³ Isso sugere que outros sistemas estejam envolvidos na regulação da apoptose.^14,15

Whyte, Meagher e Haslett (1991)¹⁶ comprovaram que o bloqueio da produção de proteínas por cicloheximidina e actinomicina-D induz apoptose de eosinófilos e neutrófilos, diferentemente dos corticosteróides. Concluíram que a apoptose é continuamente inibida pela produção de certas proteínas e induzida na ausência destas proteínas.

A mitomicina C (MMC) é uma droga anti-neoplásica e antibiótica extraída do Streptomyces caespitosus. Seu mecanismo de ação baseia-se na inibição seletiva da síntese de DNA, recombinação, troca de cromatinas irmãs e na reparação de DNA em bactérias.¹⁷

Existem poucos relatos de indução da apoptose com MMC em células de mamíferos. Schwartz et al. (1995)¹⁸relataram indução de apoptose em tumores gástricos tratados com MMC. A simples aplicação, por cinco minutos, de MMC numa concentração de 0,4mg/ml é capaz de inibir a proliferação de uma cultura de fibroblastos por 35 dias.¹⁹ Kim et al. (1999)²⁰ observaram que a MMC (0,4 mg/ml por 5 minutos) induziu, in vitro, a apoptose de fibroblastos humanos da cápsula de Tenon, primariamente cultivados.

Esta droga tem sido freqüentemente utilizada em laringologia quanto em otologia com segurança e bons resultados.^21-24

O objetivo deste estudo foi avaliar a ação da Mitomicina C sobre o índice apoptótico de eosinófilos no estroma de pólipos nasais eosinofílicos.

MATERIAL E MÉTODO

A população estudada foi constituída por pacientes portadores de PNS extensa, com faixa etária entre 16 e 79 anos, encaminhados pelo Sistema Único de Saúde - SUS - para realização de tratamento cirúrgico no Hospital São Geraldo, anexo do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais - HC-UFMG.

Critérios de inclusão: pacientes portadores de polipose nasossinusal eosinofílica com porcentagem igual ou superior a 40% de qualquer etiologia.

Critérios de exclusão: pólipos nasais unilaterais, presença de secreção purulenta ou uso de medicamentos como corticosteróides ou antialérgicos num período de 2 meses antecedentes à avaliação inicial.

Foram selecionados 9 pacientes portadores de PNS eosinofílica, com porcentagem de eosinófilos igual ou superior a 40%²⁵, no período de janeiro a junho de 2003.

Os pacientes selecionados foram submetidos a exame otorrinolaringológico completo, com especial atenção ao segmento nasal. As fossas nasais foram exploradas via rinoscopia anterior e fibronasolaringoscopia.

Foi realizado estudo comparativo experimental auto-pareado de 9 amostras de pólipos nasais eosinófílicos com tamanho aproximado de 3 mm. O grupo de estudo foi composto por culturas de fragmentos dos pólipos tratados com MMC e avaliados em zero, 12 e 24 horas para cada paciente. O grupo controle foi composto por culturas de fragmentos dos pólipos não-tratados com MMC e avaliados nos mesmos tempos horas.

As biópsias dos pólipos nasais obtidas para cultura foram realizadas no ambulatório de Otorrinolaringologia do HC-UFMG. Os fragmentos retirados foram imediatamente acondicionados em meio de cultura à temperatura ambiente. Durante a coleta foram utilizados dois tubos FALCON^®. O primeiro recebeu a amostra por um a dois minutos, sendo levemente agitado e, então, feita a transferência para o segundo tubo. Esse procedimento visou diminuir o índice de contaminação das culturas.

No Laboratório de Imunologia do Hospital São Geraldo, os fragmentos foram seccionados em seis porções e semeados numa placa de seis orifícios. Destes seis compartimentos, três formaram o grupo experimental e três o grupo controle. No grupo experimental aplicou-se MMC por cinco minutos, na concentração de 400 µg/ml¹⁹. Após a aplicação da droga, as culturas foram lavadas em meio RPMI. Para o grupo controle, não tratado com MMC, utilizou-se somente o meio RPMI. Os fragmentos contidos nos dois primeiros compartimentos, controle e experimento, foram imediatamente submetidos ao preparo para histopatologia. Os outros dois pares de amostras, cada qual contendo controle e experimento, foram encubados por 12 e 24 horas, respectivamente, em estufa a 37º C e 5% de CO₂ em meio de cultura. Ao final de cada tempo (hora 12 e 24), os fragmentos foram enviados para exame histopatológico.²⁶

O meio de cultura utilizado foi RPMI 1640, comercializado por Gibco UK²⁶, contendo 5% de soro humano AB, 2 mM de mercaptoethanol, 1 mM L-glutamina, 2mM piruvato de sódio, 10µgr/ml de estreptomicina, 100U/ml de penicilina e 5mg/ml de fungisona.

Os fragmentos de cada amostra, após retirado o sobrenadante, foram transferidos para recipientes contendo formol a 10% e encaminhados para histopatologia rotineira, após impregnação em parafina. As lâminas resultantes foram coradas pela hematoxilina-eosina (HE) e avaliadas em microscópio óptico. As imagens dos campos com infiltrado eosinofílico foram digitalizadas, armazenadas em compact disc e posteriormente analisadas em programa de morfometria. Esta parte da pesquisa foi realizada nos Laboratórios de Apoptose e de Morfometria (Departamento de Patologia Geral do ICB – UFMG).

A análise da celularidade, isto é, da eosinofilia tecidual, foi obtida através da exploração de cinco a 10 campos do microscópico óptico com aumento de 400X, contando-se o maior número de células inflamatórias por campo para obtenção da porcentagem de eosinófilos.²⁵

Para a análise do índice apoptótico (IA) foi realizada, em cada lâmina, a contagem dos eosinófilos num aumento de 1.000X em óleo de imersão, dividindo-se o total de eosinófilos em apoptose pelo total de eosinófilos contados.⁴ O eosinófilo em apoptose caracteriza-se pela perda do contato celular, condensação citoplasmática e nuclear além da coalescência ou extrusão nuclear.^4,27

O método de análise estatística utilizado foi o teste t pareado para comparação dos grupos em cada um dos tempos considerados, segundo Snedecor e Cochran (1977)²⁸. Foi considerado nível de significância de 5% e utilizado o pacote estatístico Minitab, versão 13, na análise estatística dos dados.

Este estudo foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG Parecer nº 109/02.

RESULTADOS

Foram enviados para preparo de lâminas e cálculo do índice apoptótico 9 experimentos (Figura 1).

Ao todo, foram obtidos e analisados 741 campos digitalizados. Destes, 67 foram analisados numa magnificação de 400X para quantificação da celularidade. A média de celularidade (porcentagem de eosinófilos) encontrada foi de 55,7% (48,2% – 67,5%). Para determinação do IA foram analisados 674 campos numa magnificação de 1.000X. O resultado da análise do IA obtido nos nove experimentos pode ser observado na Figura 1. No tempo hora zero, não houve diferença significativa entre os dois grupos, tratados ou não com MMC (p= 0,189). Em 12 horas, as culturas tratadas apresentaram uma taxa de apoptose significativamente maior (p<0,001) que as não tratadas. Na hora 24 não foi observada diferença significativa entre os dois grupos (p= 0,301).

Ao se analisar isoladamente o grupo não tratado com MMC, observa-se uma diferença significativa entre os tempos hora zero e 12 (p<0,001), entre os tempos hora zero e 24 (p<0,001) e entre os tempos hora 12 e 24 (p<0,001). Este padrão se mantém para o grupo tratado com MMC, no qual existe uma diferença significativa entre os tempos hora zero e 12 (p<0,001), entre os tempos hora zero e 24 (p<0,001) e entre os tempos hora 12 e 24 (p< 0,001). Como demonstrado nas Figuras de 2 a 5, o método utilizado na avaliação histopatológica mostrou-se claramente favorável à detecção de eosinófilos em apoptose.

DISCUSSÃO

A coloração por HE nos permite uma boa identificação dos eosinófilos e das mudanças histopatológicas relacionadas à apoptose. Como apresentado nas Figuras de 2 a 5, observam-se claramente a perda do contato celular, a contração citoplasmática e nuclear, além da coalescência e extrusão nucleares. Foram detectados numerosos corpos apoptóticos (extrusão citoplasmática e/ou nuclear) em cortes de 12 horas com MMC e de 24 horas, com ou sem aplicação da droga. Esse resultado demonstra que o método utilizado foi claramente favorável ao estudo histopatológico desse tipo de lesão tecidual.²⁷

A apoptose ou morte celular programada é um processo regulador da resposta inflamatória. Acredita-se que na PNS eosinofílica a inibição da apoptose determinaria retardo na remoção tecidual dos eosinófilos, os quais permaneceriam ativados, prolongando a eosinofilia e os danos teciduais.^6,8

Trabalhos mostram que altos níveis de IL-5 e GM-CSF inibem o processo apoptótico. Trabalhos de Davidsson, Anderson e Hellquist (2000)¹³ demonstraram que os eosinófilos, quando ativados nas PNS eosinofílicas, apresentam o antígeno Fas ativado como primeiro sinal da cascata apoptótica. Dessa forma, a apoptose deveria ser continuamente inibida pela produção de proteínas. Dibbert et al. (1998)¹² mostraram que a IL-5 e o GM-CSF estimulavam o gene Bcl-x_L, anti-apoptótico. Por outro lado, a função do gene BAX, pró-apoptótico, não se altera diante destas citocinas.

Cox (1995)¹¹ e Meagher et al. (1996)⁵, utilizando corticosteróides, concluíram que a inibição da apoptose ocorreria pela produção de proteínas específicas e não pela ação direta do GM-CSF. Uma prova da necessidade de produção de proteínas para a inibição da apoptose foi dada por Whyte, Meagher e Haslett (1991)¹⁶, que utilizaram cicloheximidina e actinomicina-d para induzirem apoptose em eosinófilos e neutrófilos.

A MMC é um agente antiblástico alquilante capaz de inibir a síntese de DNA¹⁷ e induzir apoptose em células de tumores gástricos.¹⁸ Kim et al. (1999)²⁰ observaram que a MMC (0,4 mg/ml por cinco minutos) induziu, in vitro, a apoptose de fibroblastos humanos da cápsula de Tenon.

A MMC tem sido largamente utilizada na prevenção de processos cicatriciais em diversas áreas da medicina.²²Uma simples aplicação de MMC, por cinco minutos, a uma concentração de 0,4 mg/ml é capaz de inibir a proliferação de uma cultura de fibroblastos por 35 dias.¹⁹ Jang, Song e Pack (2003)²⁴ estudaram a ação da MMC na concentração de 400µg/ml sobre cultura de fibroblastos de membrana timpânica, concluindo que existe diferença estatisticamente significativa na inibição da proliferação em relação ao grupo controle. Tais estudos dão suporte ao emprego da MMC na concentração de 0,4 mg/ml na presente pesquisa.

A análise do IA não mostrou diferença significativa no tempo zero para os grupos tratados ou não com MMC (p= 0,189). Em 12 horas houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p< 0,001). Este resultado reforça a ação da MMC como agente alquilante, inibindo a produção de proteínas e liberando a cascata apoptótica, o que determina alterações morfológicas e morte celular. Essas alterações foram claramente detectadas pelo método histopatológico.

Na hora 24 não houve diferença significativa entre os dois grupos, com valor de p= 0,301. Esse fato decorre do elevado IA presente nos dois grupos. No grupo não tratado com MMC, o IA aumentou progressiva e lentamente, ao contrário do grupo tratado com MMC, no qual houve uma progressão rápida do IA nas primeiras 12 horas.

Supõe-se que, como agente alquilante, a MMC bloquearia a produção de proteínas nas células envolvidas, com suspensão dos mecanismos anti-apoptóticos e liberação dos mecanismos pró-apoptóticos induzidos na ativação dos eosinófilos¹³, mas mantidos em contínuo bloqueio pela ação de citocinas como GM-CSF e IL-5.¹⁶ Sendo assim, após a aplicação de MMC, teríamos níveis teciduais de GM-CSF mais baixos, inibindo a ativação de novos eosinófilos e liberando a cascata de apoptose nos eosinófilos atingidos pela droga.^5,7,12

Observou-se, nas culturas em 24 horas do grupo não tratado com MMC, uma alta porcentagem de eosinófilos em apoptose, igualando-se ao grupo de 24 horas tratado com MMC. Tal fato se deve provavelmente à ausência de fatores de estimulação.

CONCLUSÕES

Os dados do presente estudo demostraram que a mitomicina C foi capaz de determinar o aumento do índice apoptótico em culturas de estromas de PNS eosinofílica.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho só foi possível graças à cooperação de várias pessoas e serviços, propiciando a abertura de um novo campo de estudo em nosso Departamento.

Ao Prof. José Renan da Cunha Melo, por ter me apoiado e permitido livre acesso ao seu laboratório no início de minha pesquisa.

A Edilene Matias do Amaral, pelo grande empenho e dedicação no trabalho de laboratório, com agradecimentos extensíveis ao André Macedo Vale e a Eliane Perlatto Moura.

À CAPES pelo apoio e incentivo à pesquisa.

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 Endereço para correspondência
Dr. Paulo Fernando Tormin Borges Crosara
Rua Bernardo Guimarães 2053 ap.1602
Lourdes Belo Horizonte MG 30140-082
Telfax (0xx31) 3281-4604
E-mail: pcrosara@hotmail.com

O que é o exame BERA? Quando é indicado?

Os Potenciais Evocados Auditivos de Tronco Cerebral ou simplesmente BERA (Brainstem Evoked Response Audiometry) são registros da atividade elétrica que ocorre no nosso sistema auditivo, da orelha interna até o córtex cerebral, em resposta a um estímulo sonoro. São registrados por técnicas não invasivas e não causam nenhum desconforto ao paciente. Atualmente é o método mais utilizado e indicado na prática clínica e têm se tornado cada vez mais parte integral da bateria de testes audiológicos.

Basicamente o BERA deve ser indicado para identificar anormalidades neurológicas do nervo auditivo até o tronco encefálico e para estimar o limiar auditivo e para demais situações, tais como:

• Na avaliação da audição quando os demais testes audiométricos não são possíveis ou são inconclusivos,como pode ocorrer com adultos ou crianças não cooperantes, ou com comprometimentos neurológicos;


• Para triagem nos recém-nascidos de alto risco, devido ao grande número de crianças que podem apresentar comprometimento neural;


• Na identificação de tumores do nervo auditivo com dimensões maiores que 1 cm de diâmetro;


• Na identificação de lesões difusas como a esclerose múltipla, em combinação com outros exames;


• Nas alterações não identificadas radiologicamente como é o caso das Neuropatias Auditivas;


• No auxílio da indicação de ex-sanguíneo transfusão em neonatos com hiperbilirrubinemia,sendo possível monitoração para que se determine uma alteração funcional do sistema auditivo,antes que a lesão se estabeleça;


• Na monitoração intra-operatória do estado funcional do sistema auditivo, durante neurocirurgias de fossa posterior;


• Nos pacientes em estado de coma, para fazer o prognóstico neurológico e determinar se a morte cerebral está presente.

COMO É REALIZADO EM RECÉM-NASCIDO?

Com recém-nascido é realizado o mesmo procedimento, coloca-se um fone que produz sons no começo do conduto auditivo externo. A resposta de estruturas mais internas do nosso sistema auditivo (nervo auditivo e tronco encefálico) é registrada por eletrodos colocados na testa e atrás da orelha do bebê.      

Os recém-nascidos que possuem algum indicador de risco para a deficiência auditiva deverão realizar a Triagem Auditiva Neonatal com esse procedimento.

AMBIENTE PARA REALIZAÇÃO DO BERA:

O BERA deve ser realizado em ambiente silencioso, em sala tratada acusticamente e eletricamente para que não ocorram interferências de ruído elétrico de fundo, podendo estes prejudicar a análise dos traçados.

RECOMENDAÇÕES PARA REALIZAÇÃO DO BERA:

• O paciente deve estar o mais relaxado possível na hora do exame, sem contrair nenhuma parte do corpo principalmente o pescoço e os músculos do rosto. Portanto o estado físico e emocional do paciente é de grande importância durante a realização desse exame;


• No caso das crianças, o exame é realizado em sono natural ou com indução de sedação com acompanhamento médico. As orientações pré-sedação devem ser dadas na clínica que irá ser realizado o exame.


• O cabelo deverá estar limpo, seco e livre de qualquer produto como laca ou gel.
  CUIDADOS APÓS O EXAME:

• O teste é indolor e não tem efeitos colaterais ou consequências significativas.


• O paciente pode perfeitamente voltar às atividades laborais ou outras atividades imediatamente.