Reposição volêmica com soluções salinas em pancreatite e perfil hepático de proteínas apoptóticas e de choque térmico

Ester Correia Sarmento Rios; Ana Iochabel Soares Moretti; Heraldo Possolo de Souza; Irineu Tadeu Velasco; Francisco Garcia Soriano

Laboratório de Investigação Médica (LIM-51), Departamento de Emergências Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo - USP - São Paulo (SP), Brasil

Autor correspondente

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RESUMO

OBJETIVO: A falência hepática é uma consequência da inflamação sistêmica após pancreatite aguda. Avaliou-se o efeito da reposição volêmica com soluções salinas fisiológicas ou hipertônica na produção hepática de citocinas e na expressão de proteínas ativadas por choque térmico e proteínas ligadas à apoptose durante a pancreatite aguda.
MÉTODOS: Ratos Wistar foram divididos em quatro grupos: C - animais controles não submetidos à lesão e nem ao tratamento; NT - animais submetidos à indução de pancreatite aguda e não tratados; SN - animais submetidos à indução de pancreatite aguda e tratados com solução salina normal (NaCl 0,9%); SH - animais submetidos à pancreatite aguda e tratados com solução salina hipertônica (NaCl 7,5%). A pancreatite aguda foi induzida por infusão retrógrada transduodenal de taurocolato de sódio 2,5% no ducto pancreático. Após 4, 12 e 24 horas da indução da pancreatite aguda, analisaram-se, no fígado, TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-10, caspase-2, caspase-7, APAF-1, AIF, HSP60 e HSP90.
RESULTADOS: A caspase-2 diminuiu nos grupos SN e SH (p<0,05 versus C) após 12 horas. APAF-1, AIF e HSP90 permaneceram inalterados. Após 4 horas da indução, a capsase-7 aumentou no grupo NT (p<0,01 versus C), embora se mantendo em níveis basais nos grupos reperfundidos. A HSP60 aumentou em todos os grupos após 4 horas (p<0,001 versus C). No entanto, o grupo SH mostrou menor expressão de HSP60 que o grupo SN (p<0,05). A solução salina hipertônica manteve a produção de citocinas em níveis normais. A reperfusão com volume com solução salina normal ou hipertônica, modulou significativamente a expressão de caspase-7.
CONCLUSÃO: A reposição volêmica com solução salina normal ou hipertônica foi efetiva em reduzir a caspase-7. Entretanto, somente a solução salina hipertônica foi capaz de regular a produção de citocinas e a expressão de HSP60 em todos os momentos analisados.

Descritores: Proteínas de choque térmico; Apoptose; Pancreatite; Fígado

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INTRODUÇÃO

A falência hepática pode ocorrer em consequência da síndrome da resposta inflamatória sistêmica em decorrência da pancreatite aguda. Em nossos estudos anteriores, nós demonstramos o aumento nos níveis de perioxidação lipídica e de degradação na matriz extracelular no fígado, após pancreatite.⁽¹⁾ Além disso, observamos aumento nos níveis de enzimas hepáticas no sangue, indicando dano às células do fígado. A lesão hepática associada à pancreatite aguda é mediada por citocinas inflamatórias produzidas no interior de macrófagos residentes nos tecidos ativados por mediadores inflamatórios liberados sistemicamente pelo pâncreas.⁽²⁾ O fígado, por sua vez, participa da inflamação sistêmica, liberando vários mediadores inflamatórios e e levando à lesão de outros órgãos.^(3,4) As substâncias sistemicamente liberadas durante a pancreatite, como o óxido nítrico e radicais livres, podem interferir na respiração da mitocôndria hepática e induzir apoptose.^(5,6) A morte da célula apoptótica pode desempenhar um papel importante na mortalidade e na morbidade da pancreatite aguda grave.⁽⁷⁾ A via apoptótica, por meio de receptores de morte ou pela via mitocondrial, ativa a cascata final da caspase para morte celular.⁽⁸⁾ A sinalização de receptores da morte celular tem sido associada à apoptose em várias doenças hepáticas agudas, como as induzidas por álcool e a doença hepática colestática.⁽⁹⁾ A apoptose relacionada à pancreatite aguda grave é reconhecida por ser desencadeada pela via mitoncondrial.⁽³⁾

A morte celular foi observada nas formas apoptótica e necrótica, tanto na pancreatite clínica como na experimental.⁽¹⁰⁾ As evidências atuais sugerem que a quantidade e o equilíbrio entre apoptose e necroseinfluenciam a gravidade da pancreatite aguda.⁽¹¹⁾ Recentemente, revelou-se que proteínas ativadas por de choque térmico (HSPs, do inglês heat-shock proteins) e seus cofatores estão associados às vias apoptótica e necrótica.⁽¹²⁾ HSPs são chaperonas moleculares que estabilizam e reconstroem proteínas intercelulares danificadas, evitando a agregação de proteína intracelular e tornando as células resistentes ao dano celular induzido por estresse.⁽¹³⁾

A reposição volêmica, principalmente aquela com solução salina hipertônica, demonstrou benefícios em vários aspectos fisiopatológicos de muitas doenças, em razão da melhora da hipoperfusão tecidual; da diminuição doconsumo de oxigênio; da disfunção endotelial e da depressão cardíaca; além da redução da ampla gama de citocinas pró-inflamatórias e de várias espécies oxidantes.^(14,15) Nós reportamos, anteriormente, que a terapia com solução salina hipertônica reduz o estresse oxidativo e a degeneração tecidual hepática após pancreatite.⁽¹⁾Em adição, nosso grupo mostrou os efeitos da solução salina hipertônica na expressão e na atividade de várias proteínas, incluindo a HSPs no pulmão^(16,17) e no fígado.⁽¹⁾ No entanto, não há dados na literatura acerca do efeito da solução hipertônica na apoptose hepática durante a pancreatite. Neste estudo, nós avaliamos o efeito da solução salina normal (NaCl 0,9%) e da hipertônica (NaCl 7,5%) na expressão de proteínas apoptóticas e na de HSPs, além da correlação desses fatores com a inflamação durante a pancreatite.

MÉTODOS

Indução da pancreatite

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Ética emPesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (USP). Ratos Wistar machos com peso entre 270 e 320 g foram anestesiados por via subcutânea com quetamina (10 mg/kg) e xilazina (8 mg/kg). A pancreatite aguda foi induzida pelo método bem estabelecido de infusão retrógrada de taurocolato de sódio 2,5% (1,0 mL/kg; Sigma, St. Louis, MO, USA) no ducto pancreático transduodenal, com angiocateter 24-gauge, numa taxa de infusão constante de 1 mL/min. O ducto biliar foi clampeado com pinça microcirúrgica do tipo "bulldog" no hilo hepático, para evitar o vazamento da solução de taurocolato no fígado. A pinça no hilo hepático foi liberada após a injeção. A literatura relata que esse modelo de pancreatite causa lesão hepática e reproduz a mortalidade e as mudanças patofisiológicas da pancreatite humana.⁽¹⁸⁾ No presente estudo, as análises foram realizadas em quatro grupos: grupo controle (C), que consistiu de animais que não sofreram lesão e nem foram tratados; o grupo não tratado (NT), que consistiu de animais nos quais a pancreatite foi induzida mas que não foram tratados; o grupo solução salina normal (SN), com animais nos quais a pancreatite foi induzida e os mesmos foram tratados com bólus intravenoso de solução salina normal (0,9% NaCl, 34 mL/kg); e o grupo de solução salina hipertônica (SH), com animais nos quais a pancreatite foi induzida e solução salina hipertônica (7,5% NaCl, 4 mL/kg) foi administrada pela veia jugular interna, por um período de 5 minutos, 1 hora após a indução da pancreatite. O volume infundido de solução salina normal foi equivalente a 4 mL/kg da solução hipertônica em relação ao teor de sódio. Os animais foram sacrificados e os fígados coletados 4, 12 e 24 após a indução da pancreatite.

Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa semiquantitativa

A reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa semiquantitativa (RT-PCR) foi utilizada para determinar os níveis de RNA mensageiro (mRNA) no tecido hepático. O RNA total foi extraído dos fígados congelado dos ratos com o reagente TRIzol^® (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguindo as instruções do fabricante. O RNA foi dissolvido em dietilpirocarbonato (DEPC) tratado com água e espectrofotometricamente quantificado a 260 nm. A primeira fita de c-DNA foi gerada adicionando-se RNA (1 µg) a uma mistura que continha 1 µL de transcriptase reversa ImProm-II^TM (Promega, Madison, USA); 1µL (0,5 µg/µL) de oligo (dT); 20 U/µL de inibidor recombinante de RNAse RNasin^®; 3 mM de MgCl₂; 6 µL de tampão de reação ImProm-II^TM 5X (Promega, Madison, USA); e 1 µL (0,5 mM) de mistura do dNTP (Invitrogen, Carlsbad, CA), num volume final de 20 µL. A transcrição reversa foi realizada a 42ºC, por 50 minutos, seguida de inativação por calor da transcriptase reversa a 70ºC, por 10 minutos. A amplificação por PCR foi realizada utilizando-se o equipamento Programmable Thermal Controller (MJResearch PTC-200, Watertown MA, USA). A solução de PCR continha 1 µL da síntese da primeira fita de cDNA; 2,5 µL de tampão de reação 10X PCR; 2 mM de MgCl₂; 0,5 mM de mistura do dNTP; 1 pmol/µ de cada primerespecífico; 2,5 U/µL de polimerase TaqDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA), num volume final de 25 µL. Para avaliar a abundância relativa dos transcritos entre as amostras, a RT-PCR relativa foi realizada com primers RNA ribossomal 18S, num controle interno. Os produtos da PCR foram resolvidos por eletroforese em 1% de gel de agarose, corado com brometo de etídio EtBr (Horizon, Life-Technologies, USA) e visualizado com luz ultravioleta por sistema de imagem de vídeo (Pharmacia). A avaliação densitométrica de gel corado com EtBr foi realizada comsoftware Gene Tools (Syngene, Cambridge, MA, USA). Os dados foram representados como uma função de log OD do produto do gene alvo contra o log OD do rRNA 18S. As sequências de primers específicos (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram: rRNA (320bp) senso: GAAAGATGGTGAACTATGCC e antissenso: TTACCAAAAGTGGCCCACTA; HSP60 (213pb) senso: TGACACCCTTTCTTCCAACC e antissenso: AGCAAAGGGGCTAATCCAGT; HSP90 (247pb) senso: GATTGACATCATCCCCAACC e antissenso: CTAGCCAACACCCTGAGAGC.

Western blot

Amostras de tecido congelado foram pulverizadas com nitrogênio líquido e homogeneizadas em um tampão contendo 1% de TX-100; 20 mM de Tris (pH 8,0); 10% de glicerol; 135 nM de NaCl e inibidores para enzimas proteolíticas (40 ug/mL de fluoreto de fenilmetilsulfonil e 10 ug/mL de pepstatina; Sigma, St, Louis, MO). Após a separação dos resíduos, por meio de centrifugação por 45 minutos a 14.000 g, os sobrenadantes foram preservados e a concentração proteica foi determinada pelo método de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). As amostras foram armazenadas a -80ºC até serem analisadas. A expressão proteica foi realizada utilizando-se eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida. Os tecidos hepáticos extraídos (25 a 100 ug/mL) foram à ebulição em volumes semelhantes de tampão de carregamento (150 mM de Tris-HCl; pH 6,8; 4% de SDS; 20% de glicerol; 15% de beta-mercaptoetanol; e 0,01% de azul de bromofenol) e submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida 10%. Após separação eletroforética, as proteínas foram transferidas para membrana Hybond-P (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England). As membranas foram bloqueadas com leite desnatado 5% em solução salina tamponada Tris e Tween 20 (TBST) 0,5% por 1 hora. Foram utilizados anticorpos primários contra: caspase-2 (rabbit, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology 623); caspase-7 (rabbit, 1:1000, sc-337773); fator apoptótico 1 ativador de proteases (APAF-1, sigla do inglês apoptotic protease activating factor 1, goat, 1:1000, sc-26685); fator de indução da apoptose (AIF, sigla do inglês apoptosis-inducing factor, rabbit, 1:1000, ab32516, Abcam); HSP60 (goat, 1:1000, sc1052); HSP90 a/β (goat, 1:1000, sc1055); e beta-actina (1:10000, Sigma, A5441). Todos foram incubados a 4ºC durante à noite. Após duas lavagens com TBST, diluiu-se Ab secundário conjugado com peroxidase de rábano (goat anti-rabbit polyclonal sc2004 ou rabbit anti-goat sc2768, Santa Cruz Biotechnology) na proporção 1:5.000 por 2 horas. Os resíduos foram lavados duas vezes em TBST por 30 minutos e incubados com kit de detecção de reagentes de realce de quimioluminiscência SuperSignal (Pierce, Rockford, IL, USA) e expostos a filme fotográfico Kodak O-OMAT-AR (Kodak, Rochester, NY). A intensidade da banda do mesmoblot original foi quantificada pelo software Image J (Research Services Branch, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) e normalizada a níveis de controle (controle=1).⁽¹⁷⁾

Cálculo das citocinas

As amostras de plasma foram coletadas imediatamente antes do sacrifício. As citocinas fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), interleucina (IL) 6, IL-1β e IL-10 foram medidas pelo método ELISA, de acordo com instruções do fabricante (R&D Technologies, USA).

Análise histológica

Após a fixação em formalina 10%, os tecidos hepáticos foram embebidos em parafina e cortados em secções de 4 a 6 μm. Estas foram coradas com hematoxilina-eosina e analisadas qualitativamente por luz microscópica. Foi analisada a ocorrência de dano hepático, como áreas de necrose, hemorragia, infiltrados inflamatórios e vacuolização do citoplasma. As imagens foram geradas por microscópio (Leica) conectado a uma câmera (Sony Trinitron CCD, Sony, Japan) e a um computador.

Análise estatística

Os dados foram expressos como média±desvio padrão da média (DPM). As análises foram realizadas usando osoftware SigmaStat Statistical (SigmaStat Software Inc., Chicago, IL, USA), versão 3.1. As comparações entre os grupos testados foram feitas pela análise de variância one-way (one-way ANOVA), e o teste de Tukey post-hoc foi utilizado para comparar grupos individuais (NT, SN e SH comparados entre eles mesmos e com um único grupo controle para todos os períodos) e por tempo (4, 12 e 24 horas). Valor de p<0,05 foi considerado significante.

RESULTADOS

Produção de citocinas

Quatro horas após a indução da pancreatite, observou-se aumento dos níveis plasmáticos de IL-1β (Figura 1A) nos grupos NT e SH (p<0,05 versus C). Após 12 horas, os níveis plasmáticos de IL-1β permaneceram aumentados no grupo NT (p<0,001 versus C e SH; p<0,01 versus SN). A terapia com soluções salinas normal e hipertônica manteve os níveis normais.

Os níveis plasmáticos de IL-10 (Figura 1B) aumentaram no grupo NT 4 (p<0,05 versus C; p<0,01 versus SN e SH) e 24 horas (p<0,05 versus C) após a indução da pancreatite. Os níveis de citocinas aumentaram no grupo SN após 12 horas (p<0,05 versus C).

Os níveis hepáticos de IL-1β (Figura 2A) aumentaram significativamente no grupo SN (p<0,05 versus C) após 4 horas. Após 12 e 24 horas, não observamos nenhuma diferença estatística na liberação hepática de IL-1β entre os grupos. A produção hepática de IL-10 (Figura 2B) não mudou no fígado durante as primeiras 4 horas após a indução da pancreatite. No entanto, os níveis de IL-10 aumentaram no grupo NT após 12 horas (p<0,05 versus C, SN, SH) e, após 24 horas, no grupo SN (p<0,05 versus C).

Os níveis plasmático e hepático de TNF-α e IL-6 não mudaram em nenhum grupo durante as 24 horas (dados não apresentados).

Expressão de proteínas apoptóticas

Para estudar o processo de morte celular, investigou-se a expressão das proteínas apoptóticas: APAF-1, AIF, caspase-2 e caspase-7.

As expressões de APAF-1 (Figura 3) e AIF (Figura 4) permaneceram nos níveis basais durante 24 horas.

Os precursores da caspase-2 (51kDa) e da caspase-2L foram expressos no fígado. A expressão da caspase-2L (Figura 5) não mudou nas primeiras 4 horas. Após 12 horas da indução da pancreatite, os grupos tratados com solução salina normal e hipertônica mostraram uma diminuição da expressão de caspase-2 comparada ao grupo controle (p<0,05). Após 24 horas, a expressão da caspase-2 reduziu-se em todos os grupos submetidos à pancreatite (p<0,01 versus C).

Houve aumento da expressão de caspase-7 (Figura 6) no grupo NT 4 horas após a indução (p<0.01 versus C). No entanto, os tratamentos com soluções salinas normal e hipertônica mantiveram a expressão basal dessa proteína. Após 12 e 24 horas, a expressão de caspase-7 se normalizou em todos os grupos.

Expressão gênica e proteica de HSP60 e HSP90

Não se observou nenhuma alteração na expressão gênica de HSP60 (Figura 7A) durante as 24 horas. No entanto, 4 horas após a indução da pancreatite, a expressão proteica de HSP60 (Figura 7B) aumentou em todos os grupos (p<0,001 versus C). Nesse momento, a expressão de HSP60 foi mais baixa no grupo SH em relação ao grupo SN (p<0,05). A expressão de HSP90 (Figura 8) não foi alterada em nenhum dos grupos estudados.

Análise histológica

A análise histológica qualitativa (Figura 9) mostrou áreas de necrose bem como a ocorrência de hemorragia, infiltrado inflamatório e vacuolização do citoplasma no fígado dos animais sacrificados 12 horas após a indução da pancreatite e sem tratamento.

Não se observaram diferenças entre os tratamentos com soluções isotônica e hipertônica.

DISCUSSÃO

Nós já havíamos demonstramos a ocorrência de lesão hepática durante a pancreatite e os benefícios da administração da solução salina.^(1,16) O presente estudo mostrou o perfil de citocinas e a expressão de proteínas apoptóticas e HSPs no fígado após a indução de pancreatite aguda. Os dados corroboram a hipótese da solução salina hipertônica ser um modulador imunológico, por mostrar os efeitos da tonicidade sódica por si só, como nos trabalho anteriores.

Embora se reconheça que as alterações primárias na produção das citocinas ocorram precocemente, nós observamos mudanças na produção sistêmica e local de duas citocinas após o estabelecimento da pancreatite, durante o período estudado. O grupo submetido à pancreatite sem tratamento com volume teve aumento nos níveis plasmáticos de IL-1β e IL-10 após 4 horas. Após 12 horas, este grupo mostrou aumento dos níveis de IL-1βe IL-10 no plasma e no tecido, respectivamente. Outro estudo demonstrou níveis aumentados de citocinas no plasma após a pancreatite; contudo, o teor hepático das citocinas não foi estudado.⁽¹⁸⁾

A presente análise do perfil das citocinas hepáticas demonstra que a solução salina mantém o nível normal durante 24 horas. Um aumento discreto nos níveis plasmáticos de IL-1β ocorreu durante as primeiras 4 horas após a indução da pancreatite. A IL-1β é conhecida como uma das principais citocinas mediadoras da resposta inflamatória aguda. A liberação controlada dessa citocina pode induzir a produção de NO, importante para a perfusão hepática e prevenção da apoptose no fígado.⁽¹⁹⁾ É interessante observar que os animais tratados com solução salina normal tiveram pelo menos uma das citocinas estudadas elevada em algum dos períodos analisados.

O aumento das citocinas pró-inflamatórias ja foi associado a à morte celular.⁽²⁰⁾ Nesse contexto, medimos vários elementos que participam do evento apoptótico. A pancreatite induz dano hepático e causa aumento na expressão da caspase-7. No entanto, neste estudo, o mesmo não aconteceu com a caspase-2, o AIF e o APF-1 - proteínas relacionadas às vias intrínsecas da apoptose. Devemos considerar que a via de sinalização que culmina na apoptose pode ser regulada e revertida em vários pontos.⁽⁸⁾ Além disso, a regulação da apoptose está ainda mais relacionada à ativação das caspases que ao teor das proteínas intracelulares,⁽²¹⁾ como as atividades das caspases e a relação delas com o NO. A nitrosilação da caspase modula a atividade dessas proteínase, por outro lado, poderia interferir nos eventos finais da via de apoptose.⁽²²⁾ Ambos os tratamentos, com solução salina normal e hipertônica, foram capazes de manter a expressão de casapse-7 em níveis basais. Essa modulação da caspase pode interferir no potencial apoptótico.^(23,24)

A necrose também deve ser considerada um evento importante na lesão hepática. Na verdade, observamos necrose na análise histológica. Em nossos estudos anteriores, a indução de pancreatite causou a morte da célula hepática com a liberação de alanina aminotransferase (ALT) no plasma.⁽²⁵⁾ O aumento da enzima hepática no sangue está correlacionado à lesão hepática. No fígado, a necrose geralmente é consequência de perturbação metabólica aguda com depleção do ATP, como ocorre na isquemia/reperfusão e na hepatotoxicidade aguda induzida por drogas.⁽²⁶⁾ A melhora da perfusão hepática com a administração de volume reestabelece o fornecimento de oxigênio e, consequentemente, a produção de ATP,⁽²⁷⁾ evitando necrose celular.

A indução da pancreatite por ceruleína aumentou a expressão gênica de HSPs e, simultaneamente, diminuiu a expressão dessas proteínas.⁽²⁸⁾ Neste modelo experimental de pancreatite, o perfil gênico de HSP60 e HSP90 não mudou. Da mesma forma, a expressão da proteína HSP60 aumentou 4 horas após a indução da pancreatite. A HSP60 está envolvida na regulação do sistema imune e pode ativar os receptores do tipo toll (toll-like), causando a liberação de NO. Anteriormente, nós reportamos que animais submetidos à pancreatite e tratados com solução salina normal apresentaram aumento da produção de NO concomitantemente ao aumento de vários mediadores inflamatórios.⁽²⁵⁾ Além do aumento de HSP60 em todos os grupos, o grupo tratado com solução hipertônica apresentou menor expressão de proteínas que grupo tratado com solução salina normal. Sabe-se que as HSPs são produzidas em resposta ao estresse e são reguladas pelo fator de choque térmico, que é inativado sob condições sem estresse.⁽²⁹⁾ Na verdade, mostramos os efeitos da solução salina hipertônica na redução da lesão hepática e na inflamação durante a pancreatite, além de sua correlação com a redução da HSP70.

Os benefícios da administração de fluido hipertônico foram demonstrados recentemente em pacientes com choque séptico.⁽³⁰⁾ Este estudo corrobora e elucida o papel da solução salina na regulação do sistema imune, o que está além dos efeitos hemodinâmicos.

CONCLUSÃO

A reposição volêmica com solução salina normal ou hipertônica foi efetiva em reduzir a caspase-7. Entretanto, somente a solução salina hipertônica foi capaz de regular a produção de citocinas e a expressão de HSP60 em todos os momentos analisados.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o apoio financeiro concedido pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo(FAPESP).

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 Autor correspondente:
Francisco Garcia Soriano
LIM-51, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo
Avenida Dr. Arnaldo, 455, 3º andar, sala 3.189 - Cerqueira César
CEP: 01246-903 - São Paulo (SP), Brasil
E-mail: gsoriano@usp.br

Colecistite aguda não-complicada: colecistectomia laparoscópica precoce ou tardia?

Ajith Sankarankutty, TCBC-SP^I; Luis Teodoro da Luz^II; Tercio De Campos TCBC-SP, FACS^III; Sandro Rizoli FRCSC, FACS^IV; Gustavo Pereira Fraga TCBC-SP, FACS^V; Bartolomeu Nascimento Jr^VI

^IProfessor Doutor do Departamento de Cirurgia e Anatomia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil
^IIFellow do Departamento de Terapia Intensiva do Sunnybrook Health Sciences Centre da Universidade de Toronto, Toronto, Canadá
^IIIProfessor Adjunto da Santa Casa de São Paulo e Médico do LIM 62 da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP, Brasil
^IVProfessor Titular de Cirurgia Geral e Terapia Intensiva dos Departamentos de Cirurgia e Terapia Intensiva da Universidade de Toronto, Toronto, Canadá
^VProfessor Doutor Coordenador da Disciplina de Cirurgia do Trauma do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas, SP, Brasil
^VIProfessor Mestre Assistente de Cirurgia Geral do Departamento de Cirurgia da Universidade de Toronto, Toronto, Canadá

Endereço para correspondência

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RESUMO

Metanálises recentes sugerem que a colecistectomia laparoscópica precoce (dentro de uma semana do início dos sintomas) para a doença aguda, não complicada, da vesícula biliar é segura e viável. No entanto, enquetes sobre as práticas cirúrgicas indicam que a colecistectomia laparoscópica precoce é realizada por apenas uma minoria dos cirurgiões. Além disso, o melhor momento para realização deste procedimento, bem como sua relação custo-eficácia continuam sendo uma questão de debate. A reunião de revista TBE - CiTE realizou uma avaliação crítica dos artigos mais relevantes, publicados recentemente, sobre o momento da colecistectomia laparoscópica e sua relação custo-eficácia para o tratamento da colecistite aguda não complicada e fornece recomendações baseadas em evidências sobre o tema. A literatura engloba pequenos ensaios com alto risco para vieses. Ela sugere que colecistectomia laparoscópica precoce é segura e encurta o período de internação. Há uma escassez de estudos bem desenhados e de grandes séries analisando custo-utilidade. As seguintes recomendações foram geradas: (1) a colecistectomia laparoscópica precoce deve ser tentada como o tratamento de primeira linha dentro de uma semana do início dos sintomas, e (2) O custo-efetividade da colecistectomia laparoscópica precoce deve ser avaliada em cada local, levando-se em consideração os recursos, tais como a disponibilidade de pessoal treinado e de equipamentos laparoscópicos.

Descritores: Vesícula biliar. Doença aguda. Colecistite aguda. Laparoscopia. Colecistectomia laparoscópica.

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INTRODUÇÃO

Embora assintomática na maioria das pessoas, os cálculos  biliares estão associados ao desenvolvimento de complicações significativas, tais como colecistite aguda e pancreatite aguda biliar, em cerca de 5% dessas pessoas anualmente¹. Após o primeiro episódio de colecistite aguda, o risco anual de complicações relacionadas aos cálculos biliares pode aumentar até 30% e a colecistectomia laparoscópica (CL) é o tratamento cirúrgico definitivo de primeira escolha². No entanto, o melhor momento para a CL no tratamento da colecistite aguda continua sendo uma questão de debate.

CL precoce é geralmente realizada dentro de uma semana do início dos sintomas, quando a inflamação local dificulta a visualização das estruturas, levantando preocupações sobre a possibilidade do aumento das complicações intraoperatórias. Por outro lado, a CL pode ser realizada de forma tardia  (geralmente 6 semanas após o início dos sintomas), quando a inflamação aguda esta resolvida. As metanálises recentes sugerem que a CL precoce é segura e factível^3,4. Além disso, uma análise de custo-utilidade demonstrou que CL precoce é menos cara e resulta em melhor qualidade de vida quando comparada com CL tardia⁵. Apesar da crescente literatura a favor da CL precoce, enquetes de práticas cirúrgicas nos EUA e no Reino Unido indicaram que apenas 30% e 20% dos cirurgiões, respectivamente, realizam a colecistectomia precoce^6,7.

A reunião de revista TBE - CiTE realizou uma avaliação crítica dos artigos mais relevantes, publicados recentemente, sobre o momento de colecistectomia laparoscópica e sua relação custo-eficácia para o tratamento da colecistite aguda não complicada e fornece recomendações baseadas em evidências sobre o tema.

ESTUDO 1

"Estudo populacional de 4113 pacientes com colecistite aguda: definindo o melhor momento para a colecistectomia laparoscópica"⁸

Justificativa

CL é o tratamento cirúrgico de escolha para o tratamento de colecistite aguda. No entanto, ainda há controvérsia sobre o melhor momento em que o procedimento deve ser realizado. Metanálises recentes indicam a segurança e viabilidade da CL precoce (dentro de uma semana após o início dos sintomas). No entanto, em uma metanálise de Gurusamy .³, a comparação de dois grupos (quatro dias versus sete dias após o início dos sintomas) não detectou a superioridade da CL precoce. Devido à falta de estudos avaliando o tratamento nos diversos dias da primeira semana após inicio dos sintomas, os autores realizaram uma análise populacional, comparando os resultados da CL para colecistite aguda nesses períodos.

Pergunta

Existe uma diferença nos resultados clínicos da colecistectomia laparoscópica (CL) para colecistite aguda nos vários momentos de internação hospitalar (dia de admissão [d0], d1, d2, d3, d4 / 5; d e" 6)? Neste artigo, refere-se a CL tardia o procedimento realizado 6 ou mais dias após a internação para colecistite aguda.

Principais achados desse estudo

Não houve diferença na taxa de complicações intraoperatórias entre a CL precoce ou tardia (OR 0,87; IC 0,39 - 1,94; p = 0,737). A taxa de conversão para colecistectomia aberta aumentou de 11,9% no D0 para 27,9% no D>6  (OR 2,86; IC 1,96 - 4,18; p <0,001). A taxa de complicações pós-operatórias aumentou de 5,7% para 13% na CL tardia (OR 2,45; IC 1,49 - 4,04; p <0,001). A taxa de reoperações aumentou de 0,9% para 3% (OR 3,59; IC 1,43 - 9,05; p = 0,007). O tempo de permanência pós-operatório aumentou de 6,1 dias para 8 dias (OR 1,31; IC 1,22 - 1,41; p <0,001). A duração da cirurgia também foi maior na CL tardia (OR 1,37; IC 1,02 - 1,83; p = 0,036).

Pontos fortes

• Este estudo utilizou dados coletados prospectivamente, que geralmente são mais precisos do que os dados coletados retrospectivamente.

• grande número de pacientes no estudo (4113).

• O estudo utilizou uma base de dados populacional, incluindo pacientes de diversos contextos (clínicas particulares, hospitais regionais, bem como os hospitais universitários), o que ajuda na generalização dos resultados do estudo.

• O acompanhamento foi bastante impressionante, com muito poucos dados ausentes (0,3%).

• Os resultados primários do estudo são clinicamente relevantes, uma vez que a mortalidade não é um grande problema nos casos de colecistectomia laparoscópica para colecistite aguda.

• Potenciais fatores de confusão, como idade, sexo e ASA foram ajustados.

Limitações

• O dia de hospitalização foi considerado um substituto para o início do episódio de colecistite aguda. Embora o acesso à assistência é disponível em tempo hábil no país onde o estudo foi realizado, isso pode não acontecer em outros sistemas de saúde. Portanto, os resultados do estudo podem não ser diretamente aplicáveis para outros países com maior demora para acesso ao tratamento definitivo.

• Embora seja um estudo de base populacional grande, os pacientes do estudo são na maioria caucasianos, que não é o caso em muitas outras regiões geográficas, limitando também a extrapolação dos resultados para outros grupos étnicos.

• Os autores não fornecem dados demográficos e características basais dos pacientes operados nos diferentes dias para assegurar que os grupos são equilibrados em relação aos fatores prognósticos. Apesar de ajustes para potenciais fatores de confusão (idade, sexo e ASA), a influência de variáveis de confusão não mensuradas (comorbidades, como diabetes ou cirrose, o uso de medicamentos específicos, tais como os esteróides etc.), não pode ser totalmente descartada.

• Embora o uso de resultados compostos, tais como as "complicações pós-operatórias" são geralmente úteis, estudos envolvendo grandes números de pacientes (obtidos de grandes bases de dados) tendem a encontrar diferenças estatisticamente significativas que precisam ser interpretados com cautela, avaliando sua relevância clínica. Além disso, uma proporção significativa de complicações pós-operatórias são classificados como "outras complicações", o que torna a análise da sua relevância clínica extremamente desafiador.

ESTUDO 2

"Estudo randomizado prospectivo considerando uma análise de custo-benefício na comparação da colecistectomia precoce versus a postergada na doença aguda da vesícula biliar"⁹

Justificativa

Embora a segurança da colecistectomia laparoscópica precoce tenha sido estabelecida, faltam estudos randomizados avaliando seu custo-benefício. Na doença aguda da vesícula biliar, devido à sua alta prevalência e prognóstico favorável, com taxas de mortalidade extremamente baixas, combinado com poucos recursos necessários dos sistemas de saúde, o custo-benefício pode ser considerado tão importante quanto a segurança do doente.

Pergunta

Qual é o custo-benefício da colecistectomia laparoscópica precoce quando comparada ao tratamento convencional postergado dos doentes com cólica biliar e colecistite aguda recém diagnosticada analisados em uma perspectiva de um estudo clínico?

Achados principais

A análise de custo-benefício não mostrou diferenças significativas no custo ou desfecho da colecistectomia laparoscópica precoce versus o tratamento convencional postergado nos doentes com doença aguda da vesícula biliar recém diagnosticada. O custo total médio foi de £5.911 e £6.132; e os custos sociais foram de £1.322 e £1.461 para o grupo precoce e convencional, respectivamente. Entretanto, o custo corrigido para a ferramenta qualidade ajustada de vida-ano adicional (QALY) foi a favor do tratamento convencional, a um custo de £3.810 por QALY ganho.

Pontos fortes

• Análise econômica de saúde formal em um panorama de um estudo prospectivo controlado, que permite uma melhor estimativa dos custos. Uma coleta detalhada de dados foi realizada levando em consideração os custos com o paciente internado e com as visitas ambulatoriais. Os custos não-médicos indiretos foram também estimados, e incluíram tempo fora do trabalho, custo da viagem ida e volta para o hospital, visitas nos serviços primários relacionadas à doença da vesícula biliar, e custos com medicamentos.

• O estudo foi registrado publicamente; e o desfecho do estudo assim como o tamanho da amostra foram determinados "a priori", o que adiciona credibilidade à análise.

• A análise foi realizada em uma comparação de intention-to-treat dos grupos randomizados, o que normalmente é mais apropriada em refletir a prática clínica normal.

• O processo de randomização foi claramente descrito. Embora a alocação de tratamento foi omitida dos investigadores e pacientes, o que é importante para evitar um potencial viés, por razões óbvias nenhum deles poderia ser cego ao tratamento que ele mesmo receberia.

• Altas hospitalares, fator importante na influência dos custos hospitalares, foram decididos por médicos não envolvidos no estudo.

Limitações

• O estudo foi terminado prematuramente, recrutando apenas 52% de sua amostra inicialmente planejada. A análise interina encontrou uma diferença de custo inesperadamente pequena (10 vezes menor que a diferença assumida para o cálculo da amostra) entre os grupos de estudo. Além disso, o recrutamento foi também inesperadamente lento. Os autores também decidiram terminar o estudo após um total de 72 pacientes recrutados. O término precoce reduziu o poder do estudo em mostrar uma diferença entre os grupos, o que é um risco conhecido para um erro tipo II (ex: concluindo que não é verdade, subestimando as diferenças, quando na verdade esta existe).

• Embora a alta hospitalar era decidida por médicos independentes, nenhum critério foi incluído no estudo, o que permitiu uma variação entre os médicos. Isto não permite assegurar a mesma prática entre os grupos.

• O período de seguimento para avaliação do QALY foi de apenas 30-35 dias após a colecistectomia, o que poderia ser considerado inadequado. Períodos de seguimento maiores para avaliação da qualidade de vida são normalmente mais informativos.

ESTUDO 3

"Metanálise de estudos randomizados controlados sobre a segurança e eficácia de colecistectomia laparoscópica precoce ou tardia para tratamento da colecistite aguda"³

Justificativa

Metanálises anteriores de ensaios clínicos randomizados de CL precoce versus CL tardia, durante colecistite aguda, concluíram que a CL precoce é segura e diminui o tempo de internação. CL é realizada principalmente após o episódio agudo, em muitos países. Esta meta-análise foi realizada para incluir os estudos mais recentes não incluídos no estudo publicado anteriormente, uma  revisão Cochrane sobre CL em colecistite aguda.

Pergunta

Devemos oferecer aos doentes com colecistite aguda CL precoce (até 7 dias após o início dos sintomas) ou CL tardia (após um intervalo de pelo menos 6 semanas após o início dos sintomas)?

Principais resultados

Sete ensaios clínicos foram incluídos na revisão sistemática, e 5 foram incluídos na metanálise. Os pacientes foram randomizados para CL precoce (223) e CL tardia (228). Nenhum desequilíbrio das características epidemiológicas dos dois grupos foi encontrado. Não houve diferença significativa entre os dois grupos (RR 0,64, 95% IC: 0,15-2,65, p = 0,54) em relação à lesão do ducto biliar (taxa de lesões foi de 0,5% no grupo precoce versus 1,4% no grupo tardio). Não houve diferença significativa entre os dois grupos em relação à conversão para colecistectomia aberta (RR 0,88, 95% CI: 062-1,25, p = 0,47). A taxa de conversão foi de 20,6% no grupo de CL precoce e de 23,6% no grupo de CL tardia. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos em relação a coleções intra-abdominais necessitarem de intervenções, infecções de feridas superficiais, ou infecções de feridas profundas. O tempo total de internação variou 4,1-7,6 dias no grupo precoce e 8,0-11,6 dias no grupo tardio. Em 17,5% dos pacientes do grupo CL tardia, os sintomas não se resolveram ou retornaram antes da operação planejada, e uma cirurgia de emergência foi necessária.

Pontos fortes

• No geral, o estudo foi conduzido metodologicamente de forma correta. Utilizou uma estratégia de pesquisa muito abrangente e extensa. Foi realizada avaliação rigorosa e constante do risco de viés dos estudos incluídos e avaliados de acordo com o protocolo para revisões sistemáticas. Dois autores independentemente conduziram a seleção e extração de dados.

• Quasi ECR foram excluídos, já que são mais susceptíveis a viés.

• Não houve heterogeneidade entre os estudos, como indicado pelos valores de x2 e I2.

• Modelos estatísticos de efeitos fixos e modelos de efeitos aleatórios foram utilizados para identificar diferenças entre as estimativas de efeito em todo o grupo.

• A análise do subgrupo e análise de sensibilidade foram realizadas para avaliar se as estimativas de efeito foram alteradas nos subgrupos.

• Publicação de viés foi explorada com "funnel plot". No viés de publicação foi encontrado.

Limitações

• As principais limitações estão relacionadas com os estudos originais incluídos nesta revisão.

• Risco de viés – "Blinding" não foi realizado em nenhum dos ensaios, consequentemente, eles foram considerados como alto risco de viés.

• Viés de publicação – "Funnel plot" não mostrou viés de publicação, mas havia poucos ensaios para que o teste de Egger pudesse ser realizado, com a finalidade de exploração ainda mais o viés de publicação.

• O conjunto de dados não era suficientemente grande para demonstrar pequenas diferenças nas taxas de lesão de ducto biliar nas abordagens precoce ou tardia para o tratamento da colecistite aguda.

• A probabilidade de erro alfa, tipo I (concluir erroneamente que uma intervenção é benéfica quando não é) e tipo II (concluir erroneamente que uma intervenção não é benéfica quando realmente é) por causa dos poucos estudos incluídos e da pequena amostra em cada estudo.

CONCLUSÕES DA TBE - CiTE

As conclusões baseiam-se na literatura mais recente e relevante sobre o tema, incluindo, mas não limitado, um estudo de base populacional grande, uma análise de custo-utilidade em um cenário de um ensaio clínico randomizado, e uma recente revisão sistemática e metanálise:

1. A literatura mais relevante sobre o momento ideal para a colecistectomia laparoscópica na doença aguda da vesícula biliar compreende estudos pequenos com risco de vieses, e, portanto, nenhuma conclusão definitiva pode ser tirada neste momento.

2. Na doença da vesícula biliar aguda não complicada a evidência atual sugere que colecistectomia laparoscópica precoce é segura e diminui o período de internação.

3. Devido à escassez de estudos bem desenhados e grandes com análise de custo-utilidade, o custo-benefício da CL precoce ainda é incerto. O custo-eficácia da CL precoce deve ser avaliado em cada cenário, considerando-se a disponibilidade nas 24 horas do dia de sala cirúrgica, equipe médica treinada e equipamentos de laparoscopia.

RECOMENDAÇÕES DA TBE - CiTE sobre "Colecistite aguda não-complicada: colecistectomia laparoscópica precoce ou tardia?"

1. Colecistectomia laparoscópica precoce deve ser tentada como o tratamento de primeira linha dentro de uma semana do início dos sintomas para a doença da vesícula biliar aguda não complicada.

2. O custo-efetividade da colecistectomia laparoscópica precoce deve ser avaliado em cada hospital individualmente, em função dos recursos locais, tais como a disponibilidade de equipe treinada, sala cirúrgica e de equipamento para laparoscopia.

3. Pesquisas no futuro precisam focar no que define como tempo apropriado desde o início dos sintomas e o custo-eficácia em diferentes sistemas de saúde e países.

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 Endereço para correspondência:
Bartolomeu Nascimento Jr.
Sunnybrook Health Sciences Centre
2075 Bayview Avenue, Room B5 12( Toronto, ON, Canada, M4N 3M5
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